木糖醇对黏性放线菌生长及产酸影响的体外研究

　　[摘要] 目的 对比不同质量浓度下木糖醇对黏性放线菌生长及产酸的影响。方法 分别用含不同质量浓度（128、64、32、16、8、4 g·L-1）木糖醇的脑心浸液（BHI）液体培养基在厌氧条件下培养黏性放线菌，测定其最小抑菌质量浓度（MIC）；然后测量对照组以及1/2、1/4、1/8 MIC和MIC质量浓度时培养1.5、3、6、12、24、48 h液体培养基的pH值，计算ΔpH值，同时测量2、4、6、8、10、12 h液体培养基的光密度（OD550）值；最后测定抑制50%及 90%黏性放线菌生物膜形成的最低木糖醇质量浓度（即MBIC50和MBIC90）。运用SPSS 19.0进行数据分析。结果 木糖醇能抑制黏性放线菌的生长，MIC为64 g·L-1。培养12 h后，各组之间的ΔpH值差异均有统计学意义（P<0.05），且ΔpH值随MIC质量浓度的增大而减小；此时，除1/2 MIC以及MIC组之外，其余各组的OD550差异均无统计学意义（P>0.05），OD550值随MIC质量浓度的增加而减小。提示黏性放线菌在含1/2 MIC及MIC的木糖醇培养基里生长及产酸能力随木糖醇质量浓度的升高而下降。木糖醇的MIBC50为64 g·L-1，MIBC90为128 g·L-1，说明木糖醇培养基能抑制黏性放线菌生物膜的形成。结论 木糖醇能有效地抑制黏性放线菌的生长、黏附以及产酸，有一定的抑制致龋菌和防治龋病的效果。

　　[关键词] 木糖醇；黏性放线菌；生长；产酸

　　[中图分类号]R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.03.002

　　In vitro study of xylitol on the growth and acid production of Actinomyces viscosus Guo Houzuo, Xiao Yao, Lian Xiao-tian, Zou Ling. (State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective This research aimed to study the inhibitory effect of xylitol on the growth and acid production of Actinomyces viscosus (A.?viscosus). Methods We cultivated A.?viscosus in anaerobic conditions with different concentra-tions (128, 64, 32, 16, 8, and 4 g·L?1) of xylitol brain heart infusion liquid medium and determined the minimum inhibitory concentration (MIC). Subsequently, we measured the pH value of the control group, as well as those of 1/2, 1/4, 1/8 MIC, and MIC concentration groups at 1.5, 3, 6, 12, 24, and 48 h. The ΔpH and OD550 at 2, 4, 6, 8, 10, and 12 h were calculated. We discovered that the minimum xylitol concentrations suppressed 50% and 90% A.?viscosus biofilm formation (i.e., MBIC-50 and MBIC90). SPSS 19.0 was used to analyze the collected data, and conclusions were drawn afterward. Results Xylitol inhibited the growth of A.?viscosus at MIC of 64 g·L-1. After 12 h, the differences of pH value among groups were all statisti-cally significant (P<0.05), and ΔpH increased when the MIC concentration decreased. Except for the1/2 MIC and MIC groups, the differences of OD550 among groups had no statistical significance (P>0.05), and OD550 also increased when the MIC concentration decreased. These results imply that the ability of A.?viscosus to grow and produce acid in 1/2 MIC and MIC conditions will be reduced with the increase in xylitol concentration. The value of MIBC50 was 64 g·L-1, whereas the value of MIBC90 was 128 g·L-1. This finding indicates that the xylitol medium can restrict A.?viscosus biofilm formation. Conclusion Xylitolcan effectively inhibit the growth, adhesion, and acid production of A.?viscosus, protecting teeth from cariogenic bac-teria and preventing caries to a certain extent.

　　[Key words] xylitol;Actinomyces viscosus;growth;acid production

　　木糖醇是木糖代谢的正常中间产物，长期食用含木糖醇的食品可以明显降低各类龋坏的发病率，减少口腔中变异链球菌的数量[1-2]。体外研究[3]表明，木糖醇对于口腔牙菌斑生物膜形成有抑制作用，但具体机制不明。黏性放线菌是口腔固有菌群的主要成员，能发酵多种碳水化合物产酸，对牙面尤其是牙骨质具有极强的黏附能力，在根面牙菌斑形成过程中发挥重要作用。目前研究[4-5]认为，黏性放线菌的黏附以及产酸能力可能与根面龋的发生有密切关系。目前木糖醇对黏性放线菌的黏附及产酸能力影响的报道还较少，本实验采用生长曲线测量和pH值检测分析木糖醇对黏性放线菌的影响，探索采用木糖醇防治龋病的新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验菌株、仪器及培养基制备

　　1.1.1 实验菌株 黏性放线菌ATCC 15987由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

　　1.1.2 实验仪器 厌氧培养箱（浙江义乌冷冻机总厂），METTLER TOLEDO FE20型pH计（Mettler Toledo公司，瑞士），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），TDL-40B型低频离心机（上海安亭科学仪器厂），BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司），AUTOCLAVE MLS-3780型高压灭菌机（Sanyo公司，日本），SP-ECTRONIC 200分光光度仪（Thermo Scientific公司，美国）。

　　1.1.3 木糖醇-BHI液体培养基配制 在脑心浸液（brain heart infusion，BHI）液体培养基中分别加入木糖醇粉末，调整其质量浓度为128 g·L-1，用NaOH溶液和HCl溶液调节pH值至7.40。配置200 mL上述木糖醇-

　　BHI液体培养基，另配置200 mL纯BHI液体培养基，调节pH值至7.40，立即置于121 ℃、133 MPa条件下消毒2 h，备用。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验菌株的复苏以及培养 黏性放线菌ATCC 15987冻干菌株复苏48 h后，采用平板划线法将其接种于BHI琼脂培养基中，37 ℃厌氧条件（80% N2、10% H2、10% CO2）下培养48 h，挑取单菌落经形态学及生化鉴定为纯培养物后，将菌落接种于BHI液体培养基中，厌氧培养48 h，将菌液在4 ℃下以

　　4 000 r·min-1离心5 min，PBS（pH=7.40）缓冲液洗菌2次，用比浊仪在BHI液体培养基中调整菌悬液密度至0.5 McFarland（1×108 CFU·mL-1），备用。

　　1.2.2 最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concen-tration，MIC）的测量 本实验共分为7组，6个实验组和1个对照组。实验组：含不同质量浓度木糖醇的BHI培养基+菌悬液，对照组：BHI液体培养基+菌悬液。

　　用无菌BHI液体培养基按对倍稀释法将已配制好的木糖醇-BHI培养基稀释为128、64、32、16、8、4 g·L-1共6个质量浓度梯度，外加纯BHI液体培养基，过滤除菌后各取100 μL加入96孔板中。每个孔取100 μL菌悬液加入96孔板置于微型振荡器上振荡混匀1 min，37 ℃厌氧培养48 h，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析仪测量550 nm波长下的吸光度，测定黏性放线菌的生长情况。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。与对照组相比，能抑制90%细菌生长的最低实验药物质量浓度即为MIC。

　　1.2.3 木糖醇对黏性放线菌产酸能力的影响 取菌悬液与通过二倍稀释法得到的不同梯度浓度的木糖醇-

　　BHI培养基各1 mL，接种于无菌15 mL离心管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC，且细菌终密度均为5×107 CFU·mL-1。调整各组初始pH值至7.40，37 ℃厌氧培养48 h，分别于1.5、3、6、12、24、48 h在无菌环境下测量培养物上清液pH值，并计算pH变化值?pH，?pH=初始pH-终末pH，其初始pH值为7.40。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

　　1.2.4 木糖醇对黏性放线菌生长的影响 取通过二倍稀释法得到的不同浓度梯度的木糖醇-BHI培养基各3 mL，加入玻璃试管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8 MIC和MIC。用无菌BHI液体培养基调整菌悬液密度至1×106 CFU·mL-1，并于每个玻璃管中添加300 μL，于振荡器上混匀，并调整pH值至7.40，37 ℃厌氧培养12 h。于2、4、6、8、10、12 h用SPECTRONIC 200分光光度仪测量每个试管550 nm下的光密度（optical density，OD）值，记录数据。上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

　　1.2.5 木糖醇对黏性放线菌黏附能力的影响 取通过二倍稀释法得到的不同梯度质量浓度的木糖醇-BHI培养基各200 μL加入96孔板中，使孔中木糖醇质量浓度分别达到128、64、32、16、8 g·L-1。调整菌悬液密度至5×105 CFU·mL-1，每个孔加入20 μL菌悬液并置于微型振荡器上振荡混匀1 min，37 ℃厌氧培养48 h，结晶紫生物膜染色后于HTS 7000 Plus多孔板高效分析仪测量595 nm波长下的吸光度，测得最低抑制生物膜形成质量浓度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）。将MBIC定义为：与对照组相比，能抑制50%（MBIC50）或90%（MBIC90）黏性放线菌生物膜形成的最低药物质量浓度。

　　1.2.6 数据分析 使用SPSS 19.0统计软件，采用单因素方差分析进行分析，若差异有统计学意义，采用单因素方差分析Dunnet t检验进一步比较各实验组间及实验组与对照组间的差异，检验水准α=0.05。