基于硫酸—蒽酮法对不同产地藏药线叶龙胆多糖的含量测定

　　[摘要]研究线叶龙胆药材中多糖含量的测定方法，分析不同产地线叶龙胆药材中多糖的含量。结果表明，采用硫酸-蒽酮法，操作简便，结果准确；样品经硫酸-蒽酮显色后于620 nm处测定吸收度，在此波长处溶液的吸收度与葡萄糖含量呈良好的线性关系；线性范围0. 01～0.07 g·L-1（r=0. 996 7），加样回收率99.41%，RSD 2.0%；综合考虑实验条件，确定料液比为1∶60、提取时间为50 min、乙醇浓度为4倍量（体积分数80%）。测得产自甘肃夏河的线叶龙胆中多糖质量分数为0.743%，含量最高，为线叶龙胆多糖的进一步研究奠定良好的基础。

　　[关键词]硫酸-蒽酮法；线叶龙胆；多糖

　　藏药线叶龙胆Gentiana farreri Balf.f.为龙胆科龙胆属植物，以全草入药，称高山龙胆。性味苦寒，入肝胆经，具有清热燥湿，清火定惊之功，用于湿热黄疸、喉痛、眼睛赤目，阴囊肿痛，胆囊炎等证[1-2]。多糖目前研究发现具有多种生理活性，临床应用范围广，疗效确切，具有广阔的开发前景，因此立足传统中医理论应用现代科技手段，把线叶龙胆开发成安全、方便、有效的现代制剂具有重要意义。本实验对不同产地的线叶龙胆进行了多糖含量测定，这不仅可以全面了解藏药线叶龙胆的多糖含量，同时为更合理的利用这一丰富资源提供依据。

　　1材料

　　线叶龙胆分别采自甘肃玛曲、甘肃夏河、青海互助、青海河南、青海湟源，并经中国科学院西北高原生物所陈世龙主任研究员鉴定为龙胆科龙胆属植物线叶龙胆G. farreri的干燥全草，标本存放于甘肃中医学院生药标本室。

　　UV-2102 型紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司），98-1-B 型电子调温电热套（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），B 型玻璃仪器烘干器（郑州杜甫仪器厂），DT-100 电子分析天平（江苏常熟长青仪器仪表厂），超声波清洗机，FW200高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）。

　　葡萄糖对照品（购自中国食品药品检定研究院，编号110833-200904），其他均为分析纯（AR）。

　　2方法与结果

　　2.1正交设计确定最佳提取条件[3-4] 按照提取料液比、提取时间、乙醇用量3个因素（表1），每个因素3个水平，L9（34）正交试验设计，称取线叶龙胆药材27份，以吸光度为指标，采用直观分析法、方差分析， 确定最佳工艺条件。由方差分析的结果，可以看出条件B>A>C，结合直观分析， 确定最佳提取工艺为A2B1C2，即料液比为1∶60、提取时间为50 min、乙醇浓度为4倍量（体积分数80%）。

　　2.2供试品制备、纯化

　　2.2.1制备[5-8] 取药材粗粉5 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加200 mL石油醚回流脱脂2 h，将脱脂后的药渣置于烧杯中，加入蒸馏水（1∶60），超声提取2次，过滤并合并滤液，浓缩滤液至50 mL左右，加入无水乙醇80%，放置过夜，过滤，既得粗多糖。

　　2.2.2纯化[7] 取粗多糖置于烧杯中，用适量蒸馏水溶解，转入分液漏斗中，加入 1/4体积三氯甲烷和 1/16的正丁醇，震荡静止，收集上清液。上清液重复脱蛋白质数次，直至用考马斯亮蓝 G-250检测至无蛋白为止，用活性炭脱色，加无水乙醇80%，放置过夜，过滤得纯净多糖，备用。

　　2.3标准曲线的制备

　　分别精密量取葡萄糖标准溶液0，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mL置于100 mL量瓶中，加入蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取各溶液2 mL于10 mL具塞刻度试管中，各加入6 mL硫酸蒽酮溶液，摇匀，迅速置于冰水浴中冷却，然后置沸水浴中加热10 min后，再在冷水浴中冷却。于620 nm下[8]测吸光度（A），以葡萄糖质量浓度（g·L-1）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标进行线性回归分析，绘制葡萄糖浓度-吸光度标准曲线。得回归方程A=0.010 8C+0.002 6（R2=0.996 7，N=8），表明葡萄糖质量浓度在0.01～0.07 g·L-1与吸光度呈现良好的线性关系。

　　2.4精密度试验

　　取质量浓度为0. 1 g·L-1的葡萄糖对照品溶液2 mL置于10 mL量瓶中，分别加入硫酸蒽酮，置沸水浴中加热10 min，然后置冷水浴中冷却，定容。按此方法平行做5个样，每个样重复3次，求得RSD 0.81%，表明精密度良好。

　　2.5重复性试验

　　称取2.2项下样品纯净多糖10 mg 定容于100 mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。取2 mL 置于20 mL试管中，加入硫酸蒽酮溶液，沸水浴10 min，于620 nm下测吸光度（A），平行做5个样，每个样重复3次。RSD 0.88%，表明重复性良好。

　　2.6加样回收率试验

　　吸取提取样品纯净多糖溶液1.0 mL 5份，加入2.4项下葡萄糖对照品溶液1.0 mL，按标准曲线法操作，按照2.5方法，在620 nm处测定结果见表2。

　　2.7线叶龙胆样品中多糖的含量测定[9-10]

　　吸取2.5项下纯净多糖溶液2.0 mL 3份，分别置于20 mL试管中，加入硫酸蒽酮溶液6.0 mL，沸水浴10 min，在620 nm处分别测得其吸光度。根据回归方程求出藏药线叶龙胆全草中多糖质量分数为0.231%。同理测得不同产地线叶龙胆多糖含量见表3。

　　综上所述，龙胆多糖的最佳提取条件：料液比为1∶60、提取时间为50 min、乙醇浓度为4倍量（80%），由柱形图可以看出甘肃玛曲、夏河，青海互助、湟源、河南各地的藏药线叶龙胆多糖含量不同，甘肃玛曲含量最低，甘肃夏河质量分数最高为0.743%，青海河南、湟源含量相近。

　　3讨论

　　藏药线叶龙胆多糖含量相对较高，随着产地的

　　不同而不同，这与产地的生态环境有关。

　　目前多糖提取纯化最常用的是水提醇沉及石油醚脱蛋白等[11]，但是在提取、纯化过程中操作繁琐[12]，容易产生误差，影响实验结果，所以应该更好的完善实验操作，以减少实验过程中的误差。

　　多糖类化合物是多种中草药的有效成分之一[13-14]，临床功效及生物活性已经非常明确，藏药线叶龙胆中的多糖对机体特异性体液免疫和非特异性免疫机能的促进作用与其他中药中的多糖是否有差异，并没有得到深入的研究[15-17]。为使其资源得以充分利用，今后可以深入发表文章考量，使其造福于人类。

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