两种不同胚胎培养试剂在辅助生殖中对胚胎质量及妊娠结局的影响
2022-06-08
摘 要：目的：探讨不同培养液对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的影响。方法：选取2020年1-12月行IVF-ET治疗的<30岁不孕患者181例，随机分为两组。A组使用Vitrolife培养液(63个周期)；B组使用COOK培养液(118个周期)。比较两组正常受精率、优胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、临床妊娠率、着床率和早期流产率。结果：B组正常受精率、囊胚形成率显著高于A组，平均移植胚胎数少于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；而优胚率、可利用囊胚率均比A组有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。B组虽然临床妊娠率低于A组，但着床率与A组相近，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：不同生殖中心使用不同的培养试剂，应根据本中心工作的需要，使用最适合的一套培养系统，以提高患者临床妊娠结局。
关键词：体外受精 胚胎培养试剂 妊娠结局
1978年世界第1例试管婴儿Louis Brown在英国诞生。我国大陆1988年3月10日在北京医科大学第三临床医学院成功诞生了第1例试管婴儿。之后，在湖南、广东、山东、上海等地也相继获得成功，而胚胎实验室是辅助生殖技术(ART)能否顺利开展的关键环节，是胚胎体外操作的重要场所，胚胎生长的外环境直接影响胚胎的生长发育，进而决定不孕患者接受辅助生殖技术后的临床结局。胚胎的体外培养是一个复杂的过程，其对生长环境中的多种因素，如空气质量、温度、培养液和p H值及光线等均有严格要求。自2010年开展体外受精-胚胎移植(IVF-ET)以来，临床对胚胎的培养环境进行了不断改进，改善了胚胎的发育潜能，提高了辅助生殖技术的临床妊娠结局。本文对行IVF-ET治疗的<30岁不孕患者181例临床及实验室数据进行回顾性分析，旨在探讨不同胚胎培养液对IVF-ET临床妊娠结局的影响，现分析如下。
方法：两组患者在治疗过程中，临床及实验室内外环境、培养箱固定，培养器皿为同一批号的一次性用品。(1)超排卵治疗和卵母细胞的收集：两组患者均采用常规长效长方案促排卵，于注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)36 h后取卵。在体视显微镜下，辨认出卵冠丘复合物(OCCC)，将OCCC快速转移至G-mops plus(瑞典Vitrolife)或K-SIGB(澳大利亚Cook)培养液中，用G-IVF plus(瑞典Vitrolife)或K-SIFM(澳大利亚Cook)培养液洗涤2次后，转入G-IVF plus或K-SIFM培养液中，于37℃、6%CO2、5%O2的培养箱内培养，等待授精；(2)授精及胚胎培养：IVF患者于取卵2～6 h后，将经过密度梯度离心和上游后的精液加入1 m L含有OCCC的G-IVF plus或K-SIFM培养液中，使精子终浓度达到约50万条精子/m L，精-卵过夜培养。第1天(D1)用150μL口径的剥卵针机械剥离卵母细胞周围的卵丘细胞，观察并记录原核，将受精卵转入含有G-1 plus(瑞典Vitrolife)或K-SICM(澳大利亚Cook)培养液中，置于三气培养箱中进行培养。第3天(D3)观察胚胎，除移植及冷冻胚胎外，其余胚胎转入含有G-2plus(瑞典Vitrolife)或K-SIBM(澳大利亚Cook)培养液中，置于三气培养箱中继续培养至囊胚阶段。观察并记录第5天(D5)、第6天(D6)、第7天(D7)囊胚形成情况，如有可利用囊胚及时冷冻保存。(3)胚胎移植、黄体支持及妊娠评价指标：本研究全部为新鲜移植，根据胚胎评分，优先选择8细胞的优质胚胎或3BB以上的优质囊胚进行移植，于D3或D5移植者，移植后常规肌内注射黄体酮或阴道给药黄体酮凝胶(雪偌同)进行黄体支持，于移植后14 d或12 d抽血测定β-h CG，若β-h CG>50 IU/L，移植28 d阴道超声下见孕囊为临床妊娠。
统计学方法：数据采用SPSS 11.0软件分析；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。
表1 两组正常受精率、优胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、临床妊娠率、着床率和早期流产率比较(%)
动物研究表明，不同时期的胚胎其代谢方式有所不同[2-3]，在配子期及受精过程中需要有糖及磷酸盐的成分存在，早期卵裂胚生物合成及代谢水平低，葡萄糖的利用能力低，该阶段的培养基应以丙酮酸和乳酸作为主要能源供应，不加或少加葡萄糖。2018年，方丛和梁晓燕表明了胚胎实验室质量控制对于胚胎培养的重要性[4],IVF-ET的成功取决于能否生出健康的孩子，胚胎的质量及后续发育潜能有赖于胚胎培养环境，胚胎培养的基础为培养基。本研究采用了两套不同的培养试剂(瑞典Vitrolife及澳大利亚Cook)，不同胚胎培养试剂组成成分不同，葡萄糖、能量底物、磷酸盐和其他微量营养素等可能存在细微差别。
本研究中，比较两种胚胎培养试剂的受精率、优胚率等，结果表明对于年龄<30岁的患者，COOK试剂能够获得更高的受精率及囊胚形成率，差异有统计学意义。不同发育阶段的胚胎使用序列培养基可以使各个时期具有发育潜能的胚胎数增加，对提高妊娠率和着床率非常重要。2014年，Morbeck等比较Cook与Vitrolife培养基配方[5]，结果显示两者有一个很大区别：Cook培养基含有必需和非必需氨基酸，Vitrolife培养基仅含有非必需氨基酸，而氨基酸是胚胎发育和胚胎代谢的重要元素[6]，它可以是渗透物、螯合剂、能量底物、抗氧化剂、生物合成前体和能量代谢调节剂[7]，且培养液氨基酸的组成比例也可直接影响胚胎发育[8]。本研究中，Cook试剂优胚率、可利用囊胚率等均高于Vitrolife试剂，可能与两种试剂配方中所含物质不同有关。有研究表明，Cook试剂和Vitrolife试剂对临床妊娠率无影响[9]，这与研究结果一致。
综上所述，研究结果提示两种不同培养试剂的差异对胚胎生长发育有影响，但对于临床妊娠结局无影响，均可以获得较好的临床妊娠结局。因此，对于不同生殖中心使用不同的胚胎培养试剂，应根据本中心工作的实际情况，使用最适合本中心的一套培养系统，以提高本中心患者临床妊娠结局。
参考文献
[1]汪玉宝.辅助生殖技术的发展趋势[J].国外医学计划生育分册,1998,17(2):79-82.
[2] Leppens-Luisier G,Sakkas D.Development,glycolytic activity,and viability of preimplantation mouse embryos subjected to different periods of glucose starvation[J].Biol Reprod,1997,(56):589-596.
[3] Lane M,Gardner DK.Differential regulation of mouse embryo developmeng and viability by amino acid[J].J Reprod Fertil,1997,109(1):153-164.
[4]方丛,梁晓燕.胚胎实验室质量控制[J].中华生殖与避孕杂志,2018,38(8):640-642.
[5] Morbeck DE,Krisher RL,Herrick JR,et al.Composition of commercial media used for human embryo culture[J].Fertil,2014,102(3):759-766.
[6] Houghton FD.Media composition:amino acids and cellular homeostasis[J].Methods Mol Biol,2012,912(25):97-106.
[7] Land M,Garner DK.Embryo culture medium:which is the best[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2007,21(1):83-100.
[8] Drabkova P,Andrlova L,Kandar R.An HPLC method for the determination of selected amino acids in human embryo culture,edium[J].Biomed Chromatogr,2017,31(2):3800.
[9] Zhang H,Zheng Y,Wu Y,et al.A prospective randomized comparison of early embryo cleavage kinetics between two media culture systems[J].Pak J Med Sci,2016,32(6):1375-1379.
关键词：体外受精 胚胎培养试剂 妊娠结局
1978年世界第1例试管婴儿Louis Brown在英国诞生。我国大陆1988年3月10日在北京医科大学第三临床医学院成功诞生了第1例试管婴儿。之后，在湖南、广东、山东、上海等地也相继获得成功，而胚胎实验室是辅助生殖技术(ART)能否顺利开展的关键环节，是胚胎体外操作的重要场所，胚胎生长的外环境直接影响胚胎的生长发育，进而决定不孕患者接受辅助生殖技术后的临床结局。胚胎的体外培养是一个复杂的过程，其对生长环境中的多种因素，如空气质量、温度、培养液和p H值及光线等均有严格要求。自2010年开展体外受精-胚胎移植(IVF-ET)以来，临床对胚胎的培养环境进行了不断改进，改善了胚胎的发育潜能，提高了辅助生殖技术的临床妊娠结局。本文对行IVF-ET治疗的<30岁不孕患者181例临床及实验室数据进行回顾性分析，旨在探讨不同胚胎培养液对IVF-ET临床妊娠结局的影响，现分析如下。
资料与方法
选取2020年1-12月行IVF-ET治疗的<30岁不孕患者181例，授精方式为常规IVF受精。根据使用不同培养液进行分组，A组为使用Vitrolife培养液组(63个周期)，B组为使用COOK培养液组(118个周期)。方法：两组患者在治疗过程中，临床及实验室内外环境、培养箱固定，培养器皿为同一批号的一次性用品。(1)超排卵治疗和卵母细胞的收集：两组患者均采用常规长效长方案促排卵，于注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)36 h后取卵。在体视显微镜下，辨认出卵冠丘复合物(OCCC)，将OCCC快速转移至G-mops plus(瑞典Vitrolife)或K-SIGB(澳大利亚Cook)培养液中，用G-IVF plus(瑞典Vitrolife)或K-SIFM(澳大利亚Cook)培养液洗涤2次后，转入G-IVF plus或K-SIFM培养液中，于37℃、6%CO2、5%O2的培养箱内培养，等待授精；(2)授精及胚胎培养：IVF患者于取卵2～6 h后，将经过密度梯度离心和上游后的精液加入1 m L含有OCCC的G-IVF plus或K-SIFM培养液中，使精子终浓度达到约50万条精子/m L，精-卵过夜培养。第1天(D1)用150μL口径的剥卵针机械剥离卵母细胞周围的卵丘细胞，观察并记录原核，将受精卵转入含有G-1 plus(瑞典Vitrolife)或K-SICM(澳大利亚Cook)培养液中，置于三气培养箱中进行培养。第3天(D3)观察胚胎，除移植及冷冻胚胎外，其余胚胎转入含有G-2plus(瑞典Vitrolife)或K-SIBM(澳大利亚Cook)培养液中，置于三气培养箱中继续培养至囊胚阶段。观察并记录第5天(D5)、第6天(D6)、第7天(D7)囊胚形成情况，如有可利用囊胚及时冷冻保存。(3)胚胎移植、黄体支持及妊娠评价指标：本研究全部为新鲜移植，根据胚胎评分，优先选择8细胞的优质胚胎或3BB以上的优质囊胚进行移植，于D3或D5移植者，移植后常规肌内注射黄体酮或阴道给药黄体酮凝胶(雪偌同)进行黄体支持，于移植后14 d或12 d抽血测定β-h CG，若β-h CG>50 IU/L，移植28 d阴道超声下见孕囊为临床妊娠。
统计学方法：数据采用SPSS 11.0软件分析；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。
结果
两组正常受精率、优胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、临床妊娠率、着床率和早期流产率比较：B组正常受精率、囊胚形成率显著高于A组，平均移植胚胎数少于A组，差异有统计学意义(P<0.05)；而优胚率、可利用囊胚率均比A组有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。B组虽然临床妊娠率低于A组，但着床率与A组相近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 两组正常受精率、优胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、临床妊娠率、着床率和早期流产率比较(%)
讨论
早期IVF-ET的临床妊娠率只有20%～30%[1]，近年来随着辅助生殖技术的提高，体外培养环境及培养基营养成分的不断改善，部分生殖中心的妊娠率逐步提高。要想获得理想的妊娠结局，体外培养就必须尽可能地模拟体内环境，以使配子及早期胚胎能够在更接近生理的条件下生长发育，获得与自然受孕所形成的胚胎更加接近甚至更高的发育潜能，用以提高妊娠率。因此，如何创建及维护与人体内部相似的培养条件，就成为胚胎体外培养的核心。动物研究表明，不同时期的胚胎其代谢方式有所不同[2-3]，在配子期及受精过程中需要有糖及磷酸盐的成分存在，早期卵裂胚生物合成及代谢水平低，葡萄糖的利用能力低，该阶段的培养基应以丙酮酸和乳酸作为主要能源供应，不加或少加葡萄糖。2018年，方丛和梁晓燕表明了胚胎实验室质量控制对于胚胎培养的重要性[4],IVF-ET的成功取决于能否生出健康的孩子，胚胎的质量及后续发育潜能有赖于胚胎培养环境，胚胎培养的基础为培养基。本研究采用了两套不同的培养试剂(瑞典Vitrolife及澳大利亚Cook)，不同胚胎培养试剂组成成分不同，葡萄糖、能量底物、磷酸盐和其他微量营养素等可能存在细微差别。
本研究中，比较两种胚胎培养试剂的受精率、优胚率等，结果表明对于年龄<30岁的患者，COOK试剂能够获得更高的受精率及囊胚形成率，差异有统计学意义。不同发育阶段的胚胎使用序列培养基可以使各个时期具有发育潜能的胚胎数增加，对提高妊娠率和着床率非常重要。2014年，Morbeck等比较Cook与Vitrolife培养基配方[5]，结果显示两者有一个很大区别：Cook培养基含有必需和非必需氨基酸，Vitrolife培养基仅含有非必需氨基酸，而氨基酸是胚胎发育和胚胎代谢的重要元素[6]，它可以是渗透物、螯合剂、能量底物、抗氧化剂、生物合成前体和能量代谢调节剂[7]，且培养液氨基酸的组成比例也可直接影响胚胎发育[8]。本研究中，Cook试剂优胚率、可利用囊胚率等均高于Vitrolife试剂，可能与两种试剂配方中所含物质不同有关。有研究表明，Cook试剂和Vitrolife试剂对临床妊娠率无影响[9]，这与研究结果一致。
综上所述，研究结果提示两种不同培养试剂的差异对胚胎生长发育有影响，但对于临床妊娠结局无影响，均可以获得较好的临床妊娠结局。因此，对于不同生殖中心使用不同的胚胎培养试剂，应根据本中心工作的实际情况，使用最适合本中心的一套培养系统，以提高本中心患者临床妊娠结局。
参考文献
[1]汪玉宝.辅助生殖技术的发展趋势[J].国外医学计划生育分册,1998,17(2):79-82.
[2] Leppens-Luisier G,Sakkas D.Development,glycolytic activity,and viability of preimplantation mouse embryos subjected to different periods of glucose starvation[J].Biol Reprod,1997,(56):589-596.
[3] Lane M,Gardner DK.Differential regulation of mouse embryo developmeng and viability by amino acid[J].J Reprod Fertil,1997,109(1):153-164.
[4]方丛,梁晓燕.胚胎实验室质量控制[J].中华生殖与避孕杂志,2018,38(8):640-642.
[5] Morbeck DE,Krisher RL,Herrick JR,et al.Composition of commercial media used for human embryo culture[J].Fertil,2014,102(3):759-766.
[6] Houghton FD.Media composition:amino acids and cellular homeostasis[J].Methods Mol Biol,2012,912(25):97-106.
[7] Land M,Garner DK.Embryo culture medium:which is the best[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2007,21(1):83-100.
[8] Drabkova P,Andrlova L,Kandar R.An HPLC method for the determination of selected amino acids in human embryo culture,edium[J].Biomed Chromatogr,2017,31(2):3800.
[9] Zhang H,Zheng Y,Wu Y,et al.A prospective randomized comparison of early embryo cleavage kinetics between two media culture systems[J].Pak J Med Sci,2016,32(6):1375-1379.