CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤治疗方面的研究进展

　　摘  要：当前肿瘤疾病依然是威胁人们健康、生活质量的一个重要因素，探寻有效的干预手段来缓解肿瘤疾病发展甚至是治愈肿瘤是临床的重要课题，准确的诊断手段、对病情发展与干预程度的评估是控制病情的前提，随着对基因编辑技术了解逐渐深入，近年来尝试将其应用于治疗肿瘤并取得了一定的成效，其中规律成簇间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白核酸酶9 (Regular cluster interval short palindrome repeats/CRISPR-related protein nuclease 9,CRISPR/Cas9）是相对新型的基因编辑手段，通过该技术不但能够准确完成RNA导向，同时还可实现对于DNA的识别、编辑，这种手段让基因编辑技术在高效、安全等方面得到厚实基础，随着该技术的深入已经实现在碱基水平基础上完成定点修饰基因的操作，为该基因编辑技术治疗肿瘤提供可靠的科学依据。CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来被应用于治疗肿瘤，该文就对该技术的分子机制以及对于肿瘤疾病的治疗研究相关进展情况作出综述，为以后临床应用该技术治疗肿瘤疾病提供可参考数据。

　　关键词：CRISPR/Cas9基因编辑技术 肿瘤 基因治疗 研究进展

　　张波等[1]在其研究当中指出了肿瘤细胞本身具备多种遗传信息变化情况，系列基因突变是肿瘤出现、发展、演进、恶化的前提，对于此类突变基因准确识别其功能，并据此寻求对突变基因的修复手段，对肿瘤疾病出现、发展有一定的鉴别诊断价值[2]，同时也是肿瘤治疗新思路的一条可靠方向。即使有这样的思路，但基因数量极大程度影响了确认在肿瘤各个阶段中那些基因突变发挥的重要作用。基因编辑手段能够精确地在DNA水平上改变遗传信息甚至模拟细胞由于遗传信息的变化而出现对应的生物学过程(包括恶性特征、耐药性变化)[3]，可作为对肿瘤疾病发展及治疗肿瘤的新思路。规律成簇间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白核酸酶9 (Regular cluster interval short palindrome repeats/CRISPR-related protein nuclease 9,CRISPR/Cas9)在肿瘤研究、治疗中取得良好的成效。

　　1 CRISPR/Cas9系统简介

　　CRISPR/Cas9系统最早是在细菌当中被发现，在细菌中发挥防御作用，在2013年科学家将CRISPR/Cas9系统作用于编辑哺乳动物基因中，在自然界将CRISPR/Cas9系统从性质、作用方面划分为3种类型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是基因编辑的主要系统，包含了Cas9蛋白、CRISPR RNA、反式激活RNA3个部分。有学者将CRISPR/Cas9系统当中的CRISPR RNA与反式激活RNA互补配对进行改造，将其称为单链g RNA，让CRISPR的技术应用进一步得到优化。

　　随着CRISPR/Cas9技术在临床的应用逐渐深入，其应用价值得到认证，不但具备强大的编辑操作功能，且相对简单，成本较低，有较高的特异性，能够在短时间内精准地筛选整个基因组，在特定疾病基因鉴定方面有着突出价值。到目前为止学者[6]已经将CRISPR/Cas9技术应用到对活细胞DNA还有核苷酸序列的编辑操作当中，针对类型包括不同物种以及细胞类型，而该技术手段的完善也逐渐改善脱靶效应不良反应，且作为基因组编辑手段也让基因定点修饰技术的高效构建提供基础[7]。

　　2 CRISPR/Cas9在肿瘤疾病的价值

　　(1)癌症动物模型。建立癌症动物模型是对癌症基因相关功能的一个重要研究手段，在以往的动物模型建立过程中操作技术被应用在受精卵水平，借助同源重组技术完成胚胎肝细胞的基因编辑操作。CRISPR/Cas9在临床的应用对癌症动物模型有突出的简化优势[8]，在这种技术推动下不需要建立过于复杂的ES细胞系，对于控制时间与资源成本都有重要意义[9]。近年来科学家开始尝试利用水流动力学注射，在小鼠尾静脉将Cas8、g RNAs质粒诸如到野生型小鼠的体内[10]，短时间内便成功取得肝癌小鼠的相关模型，研究该模型对于推动对肝癌治疗有重要价值。在成功建立肝癌模型的同时期相关研究团队成功建立小鼠肺癌模型，这些都借助Cas9基因，对于肿瘤研究与诊治产生极大的推动作用[11]。

　　当前临床对于脑瘤的发病机制与治疗方案在了解程度依然存在明显不足，在该病的控制干预方面也是难以取得预期效果[12]。在2016年首次通过CRISPR/Cas9技术完成小鼠脑瘤模型的建立，有效调整了脑瘤动物模型所存在的缺陷，在脑瘤相关靶点研究过程中更具针对性[13]。

　　(2)研究癌症发生机制。对肿瘤的研究过程中，借助离体细胞培养是其中的重要手段，CRISPR/Cas9技术帮助临床相关研究者能够更深入系统地掌握肿瘤细胞系[14]，以往研究中都是使用Cas9蛋白切割靶DNA，而DNA双链出现断裂之后主要通过以下两种手段修复[15]：非同源末端连接、同源末端连接。其中借助非同源末端连接修复之后会发生插入/缺失突变情况，让DNA双链出现转码突变、无义突变，最终得到基因敲除效果。通过CRISPR/Cas9表达载体的手段将神经胶质瘤细胞当中表达程度较高的Pyk2敲除，并控制胶质瘤细胞的迁移、增值以及威胁程度，帮助学者了解间质瘤出现、恶化的过程，也为以后研究、治疗间质瘤提供理论基础[16]。

　　3 CRISPR/Cas9对肿瘤疾病的治疗价值

　　(1）基因修复、敲除。肿瘤细胞出现及形成的过程中无论是原癌基因被激活或者是抑癌基因被抑制，都可能在其中发挥着重要作用，因此对肿瘤的预防与治疗可以从激活、提升抑癌基因表达入手[17]。慢性髓系白血病的发病已经确认和体内的抑癌基因ASXL1突变之间存在密切联系，同时病情预后也有所影响。有学者[18]将CRISPR/Cas9技术对KBM5细胞当中ASXL1无效突变进行修复从而控制KBM5细胞增殖速度，提升细胞分化能力，极大程度延长了荷瘤小鼠生存时间。

　　另外表观遗传学在肿瘤的出现过程也扮演着重要角色[19-21]，在肿瘤的出现与发展过程中，表观遗传学和CRISPR/Cas9系统都能够对其中关键基因在表达方面造成影响，彰显了对肿瘤治疗的潜力。

　　(2）破解机体免疫耐受。肿瘤细胞一旦存在于体内，自身组织相容性复合体会随着机体状态而不断调整修饰，从而得到免疫耐受的状态，避免免疫系统的抑制、杀灭，因此有学者[22]尝试通过将该免疫耐受打破，达到治疗效果。当前肿瘤细胞免疫治疗手段主要有两种：(1)特异性T细胞受体修饰基础上的T细胞治疗；(2)嵌合抗原受体修饰基础上的T细胞治疗[23]。这两种免疫干预手段机制都在于识别T细胞表面表达特异性受体，达到识别特异性并杀伤靶细胞免疫应答反应，而基于嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗应用于血液肿瘤、非霍奇金淋巴瘤疾病都有突出效果[24]，但该治疗思路存在的缺陷在于会导致修饰细胞基因到受体细胞基因组上面难以控制，治疗期间可能出现各种遗传相关不良反应[25]。在2017年基于CRISPR/Cas9构建了更新的嵌合抗原受体修饰基础T细胞[26]，编辑T细胞当中的TRAC基因并选择性地送入到受体细胞基因组，可有效控制相关不良反应，同时也提升了T细胞的治疗效果。

　　4 小结与展望

　　恶性肿瘤致死率仅次于心血管疾病，且患者患病、治疗、调整期间均受到病情症状的折磨与影响，严重降低患者的生活质量，威胁人类生存[27]。在结合相关临床实践以及文献内容后，可知在可预见的未来中对肿瘤疾病应用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行研究、治疗均有极大的发展潜力，但在这条研究的道路上也应该清晰认识到，这项技术还存在很多可改善进步的地方[28]，较为典型的如人体伦理问题、脱靶效应、安全性风险等，但相信随着研究不断深入和技术的发展，CRISPR/Cas9技术会得到完善与创新，最终一一解决相关难题，为肿瘤患者提供福音。

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