转染HO—1对酒精诱导的成骨细胞损伤的保护作用
2022-06-08
血红素加氧酶1（HO-1）属于一种热休克蛋白，是血红素分解的限速酶，能将血红素分解为胆绿素、CO和NO等，能够被多种氧化应激因素和细胞因子激活，在体内具有抗氧化、抗炎症反应和免疫调节等重要作用[1]，对动植物均具有保护作用。大量临床研究证实长期过量酒精暴露的人群，其发生骨代谢紊乱、骨质疏松或股骨头坏死的概率明显高于正常人群[2-3]。另有研究发现酒精能够增加骨折发生的风险并且减缓骨折的愈合[4]。近年有研究发现酒精对骨代谢的影响与酒精引起的氧化应激反应[5-6]有密切关系。因而本次研究尝试将人HO-1转染进入体外培养的人成骨细胞中，观察转染HO-1基因后人成骨细胞对酒精的耐受性及细胞分泌BMP-2和TGF-β1水平的影响，从而为HO-1能否用作治疗酒精性骨代谢疾病的生物制剂提供理论依据。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）、MTT（Sigma公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天），HO-1真核表达质粒（Biovector science Lab），MDA、ROS检和SOD检测试剂盒（碧云天），BMP-2和TGF-β1 ELISA检测试剂盒（R&D Systems， Inc.），Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences），723分光光度计（上海光谱仪器有限公司），Sunrise酶标仪（Tecan公司），930A荧光分光光度计（上海三科仪器有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1人成骨细胞的分离培养参照杨玉生等[7]的方法分离培养正常人成骨细胞。将分离的成骨细胞充分打散后悬于DMEM培养液（含10%胎牛血清）中置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液。
1.2.2人成骨细胞HO-1转染和实验分组取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×104/mL接种于96孔板中，当细胞铺满>80%时，按照Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒说明进行操作，设置空白对照组（未转染）、100 nmol/L HO-1质粒转染组，每组设6个平行样。转染24 h后，荧光显微镜下观察转染效果。实验中设置阴性对照组（不加酒精、未转染HO-1），阳性对照组（加100 mmol/L酒精、未转染HO-1）和HO-1转染组（加100 mmol/L酒精、转染HO-1），实验中酒精浓度参考文献[5]。
1.2.3MTT检测细胞活性各组细胞酒精暴露24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，继续培养4 h，弃上清液，加150 μL DMSO，室温下震荡10 min，用酶标仪于490 nm测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞活性=（实验组OD值/阴性对照组OD值）×100%。
1.2.4细胞中ROS测定调整细胞浓度至2×105/mL，接种于已放有灭菌盖玻片的6孔板中，细胞转染及分组情况同1.2.2。酒精作用24 h后，PBS缓冲液漂洗盖玻片2次，按照ROS检测试剂盒说明进行操作，荧光分光光度计测定各组细胞的荧光强度。
1.2.5细胞中MDA和SOD含量的测定调整细胞浓度至1×106/mL，接种于6孔板中，细胞转染和分组同1.2.2。酒精作用24 h后，首先收集细胞培养液上清液用于BMP-2和TGF-β1的检测，然后收集细胞并超声粉碎细胞，提取细胞蛋白。按照MDA和SOD试剂盒说明分别检测细胞中MDA和SOD的含量。
1.2.6ELISA法检测细胞上清液中BMP-2和TGF-β1将1.2.5中收集的细胞上清液采用双抗体夹心酶联免疫法检测细胞分泌的 BMP-2和TGF-β1。严格按照试剂盒说明配制标准品及样品，用酶标仪测定各样品的吸光度值，并计算细胞中BMP-2和TGF-β1相应的含量。
1.3统计学方法
计量资料均以均数±标准差（x±s）表示。采用spss 13.0进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较时，方差齐采用SNK法，方差不齐采用Games-Howell法。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1转染HO-1后成骨细胞形态
转染HO-1质粒24 h后，荧光显微镜下观察成骨细胞形态，可见成骨细胞正常贴壁生长，细胞呈多边形，四周有多个突起，荧光物质均匀分布于成骨细胞胞浆中，见图1。
2.2细胞活性检测结果
100 mmol/L酒精作用24 h，阳性对照组和HO-1转染组的相对细胞活性为（40.33±9.18）%和（67.35±6.90）%。与阴性对照组相比，酒精作用后阳性对照组和HO-1转染组细胞活性均明显降低（P<0.05）。但HO-1转染组相对细胞活性明显高于阳性对照组细胞活性，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
2.3细胞中ROS、SOD和MDA检测结果
酒精作用成骨细胞24 h，细胞中ROS、 SOD和MDA的含量变化见表1。100 mmol/L酒精作用于成骨细胞后，ROS和MDA含量均较阴性对照组明显升高（P<0.05），而SOD活力单位比阴性对照组明显降低（P<0.05）。当酒精作用于转染HO-1成骨细胞后，虽然ROS、 SOD和MDA变化与阳性对照组相似（与阴性对照组相比），但与阳性对照组相比，ROS和MDA升高量明显降低，SOD活力明显升高（P<0.05）。
2.4细胞中BMP-2和TGF-1含量检测结果
与阴性对照组相比，阳性对照组和HO-1转染组酒精作用24 h，细胞中BMP-2和TGF-β1水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与阳性对照组相比，酒精作用后HO-1转染组细胞中BMP-2和TGF-β1水平明显降低（P<0.05），见表2。
3讨论
虽然适量的饮酒对骨代谢是有益处的[8]，但长期过量饮酒则能引起机体骨质丢失，且研究证实饮酒已成为骨质疏松和股骨头坏死的重要危险因素[2]。酒精对骨代谢的机制主要包括：（1）酒精能够抑制成骨细胞的活性和增殖，同时还能抑制其前体细胞形成[9];（2）酒精能诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞，减少成骨细胞的分化[10]，即酒精致骨髓基质细胞成脂分化学说;（3）酒精能干扰体内其他激素的活性，如PTH、糖皮质激素等。
HO是广泛存在于动植物体内的微粒体酶系统，参与多种生理病理过程，包括三种同工酶HO-1、HO-2和HO-3。HO-1为诱导性，能被氧化应激和炎性反应因子等激活，具有非常强的抗氧化损伤、抗炎症反应和免疫调节能力[1]。有研究发现HO-1不仅能够诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞[11]，而且HO-1能够通过抑制巨噬细胞集落刺激因子受体c-fms而抑制破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞，从而减少骨吸收[12]。本实验中，笔者利用基因转染技术将HO-1转染到人成骨细胞中，使细胞中HO-1特异性高表达，从而观察其对酒精损伤作用的耐受性，研究特异转染HO-1是否能够对酒精诱导的成骨细胞损伤有抑制作用。本次研究中MTT结果显示，与阴性对照组细胞相比，虽然HO-1转染组细胞活性也明显降低，其细胞活性却明显高于阳性对照组细胞活性。由此可见，当人成骨细胞转染HO-1后，细胞抵抗酒精损伤的能力明显增强。据此笔者推测，HO-1特异性高表达后能够有效抑制酒精对成骨细胞的损伤作用，对成骨细胞起到保护作用。
成骨细胞能够分泌骨形成蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β），在骨的形成和修复中起重要作用[13]。其中TGF-β1与骨的代谢关系最密切，调控骨髓间充质干细胞的增殖并诱导其向成骨细胞分化。BMP-2具有较强的诱导成骨细胞分化能力，也能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，是公认的高效的成骨诱导因子[14]。有研究发现骨折4周后，骨痂中BMP-2和TGF-β的表达量均已明显降低，进而延缓骨折的修复和愈合，由此可见骨折后，BMP-2和TGF-β表达过低是导致骨质疏松骨折愈合缓慢的可能原因之一[15]。本次实验结果显示，转染HO-1组成骨细胞中的BMP-2和TGF-β1表达量明显高于阳性对照组。这一结果表明，转染HO-1不仅可以增强酒精作用后成骨细胞的活性，同时还能使成骨细胞中BMP-2和TGF-β1增加。笔者推测转染HO-1可以加速酒精诱导的骨质疏松和骨折的愈合，但还有待进一步的实验证明。
氧化应激是机体内氧化与抗氧化作用的失衡，能够对机体造成脂质过氧化、DNA氧化损伤等危害。ROS是引起机体发生氧化应激的重要氧化物质，MDA则是脂质过氧化的终产物，而SOD则是机体重要的抗氧化酶。这些物质的变化能够直接反映机体氧化平衡状态。已有的研究表明大量的酒精能够使机体氧化水平升高，而抗氧能力下降，当抑制体内氧化物质形成时，则能改善酒精引起的骨损伤作用[3]。HO具有较强的抗氧化作用，因而当机体内发生氧化应激反应时 本文由wWw.DyLw.NeT提供，第一论 文 网专业代写教育教学论文和论文代写以及发表论文服务，欢迎光临dYlw.nET，HO系统被激活而发挥抗氧化作用，减少氧化应激反应对机体的损伤。本次研究结果显示，当酒精作用于成骨细胞后，阳性对照组成骨细胞中的ROS和MDA含量明显高于阴性对照组，本次实验结果证实酒精能够诱导成骨细胞发生氧化应激反应，与以往的研究相一致[5]。但本次实验中HO-1转染组成骨细胞中ROS和MDA含量明显低于阳性对照组，而SOD含量则明显高于阳性对照组，由此可见转染HO-1能够明显地抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应，对成骨细胞起到保护作用。
总之，本次实验结果表明，转染HO-1能够增强酒精作用后成骨细胞的活性，对成骨细胞有保护作用。其保护作用机制可能与HO-1抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应有关。另外HO-1转染后成骨细胞BMP-2和TGF-β1的分泌的量明显增加，增强间充质细胞成骨分化，进而提高机体对酒精造成的骨损伤的修复能力。
参考文献
[1]Araujo JA， Zhang M， Yin F. Heme oxygenase-1， oxidation， inflammation， and atherosclerosis[J]. Front Pharmacol，2012，3：119.
[2]Chakkalakal DA. Alcohol-induced bone loss and deficient bone repair[J]. Alcohol Clin Exp Res，2005，29（12）：2077-2090.
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）、MTT（Sigma公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天），HO-1真核表达质粒（Biovector science Lab），MDA、ROS检和SOD检测试剂盒（碧云天），BMP-2和TGF-β1 ELISA检测试剂盒（R&D Systems， Inc.），Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences），723分光光度计（上海光谱仪器有限公司），Sunrise酶标仪（Tecan公司），930A荧光分光光度计（上海三科仪器有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1人成骨细胞的分离培养参照杨玉生等[7]的方法分离培养正常人成骨细胞。将分离的成骨细胞充分打散后悬于DMEM培养液（含10%胎牛血清）中置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液。
1.2.2人成骨细胞HO-1转染和实验分组取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×104/mL接种于96孔板中，当细胞铺满>80%时，按照Lipofectamine 2000质粒转染试剂盒说明进行操作，设置空白对照组（未转染）、100 nmol/L HO-1质粒转染组，每组设6个平行样。转染24 h后，荧光显微镜下观察转染效果。实验中设置阴性对照组（不加酒精、未转染HO-1），阳性对照组（加100 mmol/L酒精、未转染HO-1）和HO-1转染组（加100 mmol/L酒精、转染HO-1），实验中酒精浓度参考文献[5]。
1.2.3MTT检测细胞活性各组细胞酒精暴露24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，继续培养4 h，弃上清液，加150 μL DMSO，室温下震荡10 min，用酶标仪于490 nm测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞活性=（实验组OD值/阴性对照组OD值）×100%。
1.2.4细胞中ROS测定调整细胞浓度至2×105/mL，接种于已放有灭菌盖玻片的6孔板中，细胞转染及分组情况同1.2.2。酒精作用24 h后，PBS缓冲液漂洗盖玻片2次，按照ROS检测试剂盒说明进行操作，荧光分光光度计测定各组细胞的荧光强度。
1.2.5细胞中MDA和SOD含量的测定调整细胞浓度至1×106/mL，接种于6孔板中，细胞转染和分组同1.2.2。酒精作用24 h后，首先收集细胞培养液上清液用于BMP-2和TGF-β1的检测，然后收集细胞并超声粉碎细胞，提取细胞蛋白。按照MDA和SOD试剂盒说明分别检测细胞中MDA和SOD的含量。
1.2.6ELISA法检测细胞上清液中BMP-2和TGF-β1将1.2.5中收集的细胞上清液采用双抗体夹心酶联免疫法检测细胞分泌的 BMP-2和TGF-β1。严格按照试剂盒说明配制标准品及样品，用酶标仪测定各样品的吸光度值，并计算细胞中BMP-2和TGF-β1相应的含量。
1.3统计学方法
计量资料均以均数±标准差（x±s）表示。采用spss 13.0进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较时，方差齐采用SNK法，方差不齐采用Games-Howell法。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1转染HO-1后成骨细胞形态
转染HO-1质粒24 h后，荧光显微镜下观察成骨细胞形态，可见成骨细胞正常贴壁生长，细胞呈多边形，四周有多个突起，荧光物质均匀分布于成骨细胞胞浆中，见图1。
2.2细胞活性检测结果
100 mmol/L酒精作用24 h，阳性对照组和HO-1转染组的相对细胞活性为（40.33±9.18）%和（67.35±6.90）%。与阴性对照组相比，酒精作用后阳性对照组和HO-1转染组细胞活性均明显降低（P<0.05）。但HO-1转染组相对细胞活性明显高于阳性对照组细胞活性，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
2.3细胞中ROS、SOD和MDA检测结果
酒精作用成骨细胞24 h，细胞中ROS、 SOD和MDA的含量变化见表1。100 mmol/L酒精作用于成骨细胞后，ROS和MDA含量均较阴性对照组明显升高（P<0.05），而SOD活力单位比阴性对照组明显降低（P<0.05）。当酒精作用于转染HO-1成骨细胞后，虽然ROS、 SOD和MDA变化与阳性对照组相似（与阴性对照组相比），但与阳性对照组相比，ROS和MDA升高量明显降低，SOD活力明显升高（P<0.05）。
2.4细胞中BMP-2和TGF-1含量检测结果
与阴性对照组相比，阳性对照组和HO-1转染组酒精作用24 h，细胞中BMP-2和TGF-β1水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与阳性对照组相比，酒精作用后HO-1转染组细胞中BMP-2和TGF-β1水平明显降低（P<0.05），见表2。
3讨论
虽然适量的饮酒对骨代谢是有益处的[8]，但长期过量饮酒则能引起机体骨质丢失，且研究证实饮酒已成为骨质疏松和股骨头坏死的重要危险因素[2]。酒精对骨代谢的机制主要包括：（1）酒精能够抑制成骨细胞的活性和增殖，同时还能抑制其前体细胞形成[9];（2）酒精能诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞，减少成骨细胞的分化[10]，即酒精致骨髓基质细胞成脂分化学说;（3）酒精能干扰体内其他激素的活性，如PTH、糖皮质激素等。
HO是广泛存在于动植物体内的微粒体酶系统，参与多种生理病理过程，包括三种同工酶HO-1、HO-2和HO-3。HO-1为诱导性，能被氧化应激和炎性反应因子等激活，具有非常强的抗氧化损伤、抗炎症反应和免疫调节能力[1]。有研究发现HO-1不仅能够诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞[11]，而且HO-1能够通过抑制巨噬细胞集落刺激因子受体c-fms而抑制破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞，从而减少骨吸收[12]。本实验中，笔者利用基因转染技术将HO-1转染到人成骨细胞中，使细胞中HO-1特异性高表达，从而观察其对酒精损伤作用的耐受性，研究特异转染HO-1是否能够对酒精诱导的成骨细胞损伤有抑制作用。本次研究中MTT结果显示，与阴性对照组细胞相比，虽然HO-1转染组细胞活性也明显降低，其细胞活性却明显高于阳性对照组细胞活性。由此可见，当人成骨细胞转染HO-1后，细胞抵抗酒精损伤的能力明显增强。据此笔者推测，HO-1特异性高表达后能够有效抑制酒精对成骨细胞的损伤作用，对成骨细胞起到保护作用。
成骨细胞能够分泌骨形成蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β），在骨的形成和修复中起重要作用[13]。其中TGF-β1与骨的代谢关系最密切，调控骨髓间充质干细胞的增殖并诱导其向成骨细胞分化。BMP-2具有较强的诱导成骨细胞分化能力，也能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，是公认的高效的成骨诱导因子[14]。有研究发现骨折4周后，骨痂中BMP-2和TGF-β的表达量均已明显降低，进而延缓骨折的修复和愈合，由此可见骨折后，BMP-2和TGF-β表达过低是导致骨质疏松骨折愈合缓慢的可能原因之一[15]。本次实验结果显示，转染HO-1组成骨细胞中的BMP-2和TGF-β1表达量明显高于阳性对照组。这一结果表明，转染HO-1不仅可以增强酒精作用后成骨细胞的活性，同时还能使成骨细胞中BMP-2和TGF-β1增加。笔者推测转染HO-1可以加速酒精诱导的骨质疏松和骨折的愈合，但还有待进一步的实验证明。
氧化应激是机体内氧化与抗氧化作用的失衡，能够对机体造成脂质过氧化、DNA氧化损伤等危害。ROS是引起机体发生氧化应激的重要氧化物质，MDA则是脂质过氧化的终产物，而SOD则是机体重要的抗氧化酶。这些物质的变化能够直接反映机体氧化平衡状态。已有的研究表明大量的酒精能够使机体氧化水平升高，而抗氧能力下降，当抑制体内氧化物质形成时，则能改善酒精引起的骨损伤作用[3]。HO具有较强的抗氧化作用，因而当机体内发生氧化应激反应时 本文由wWw.DyLw.NeT提供，第一论 文 网专业代写教育教学论文和论文代写以及发表论文服务，欢迎光临dYlw.nET，HO系统被激活而发挥抗氧化作用，减少氧化应激反应对机体的损伤。本次研究结果显示，当酒精作用于成骨细胞后，阳性对照组成骨细胞中的ROS和MDA含量明显高于阴性对照组，本次实验结果证实酒精能够诱导成骨细胞发生氧化应激反应，与以往的研究相一致[5]。但本次实验中HO-1转染组成骨细胞中ROS和MDA含量明显低于阳性对照组，而SOD含量则明显高于阳性对照组，由此可见转染HO-1能够明显地抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应，对成骨细胞起到保护作用。
总之，本次实验结果表明，转染HO-1能够增强酒精作用后成骨细胞的活性，对成骨细胞有保护作用。其保护作用机制可能与HO-1抑制酒精诱导的成骨细胞氧化应激反应有关。另外HO-1转染后成骨细胞BMP-2和TGF-β1的分泌的量明显增加，增强间充质细胞成骨分化，进而提高机体对酒精造成的骨损伤的修复能力。
参考文献
[1]Araujo JA， Zhang M， Yin F. Heme oxygenase-1， oxidation， inflammation， and atherosclerosis[J]. Front Pharmacol，2012，3：119.
[2]Chakkalakal DA. Alcohol-induced bone loss and deficient bone repair[J]. Alcohol Clin Exp Res，2005，29（12）：2077-2090.