盐酸戊乙奎醚对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障损害的保护作用
2022-06-08
作者单位： 032200山西省汾阳，山西医科大学汾阳学院临床医学系 汾阳医院心血管内科 （王元明）;河北联合大学附属医院神经外科（杨鹏）
内毒素（lipopolysaccharide， LPS）性脑损伤是一种弥散性脑功能障碍[1]，全身炎症反应是引起内毒素性脑损伤可能原因之一[2]。盐酸戊乙奎醚（penhyclidine hydrochloride， PHC）为新型选择性抗胆碱能药物，具有中枢及外周抗毒蕈碱和抗烟碱样作用，能够通过血脑屏障进入脑内，减少炎症渗出反应[3]。目前关于PHC对内毒素性脑损伤的影响研究较少。本研究通过评价PHC对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障损害的保护作用，为临床治疗患者提供参考。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
清洁级成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠81只，体质量220～250 g，由山西省长治医学院实验动物中心提供。将81只大鼠按随机数字表分为3组，对照组（C组）、内毒素性脑损伤组（LPS组）和盐酸戊乙奎醚治疗组（PHC组），每组27只。所有操作遵循山西省长治医学院实验动物管理委员会相关规定。
1.2大鼠内毒素性脑损伤模型制备
LPS组和PHC组大鼠制备内毒素性脑损伤模型，制备方法参照文献[4]的方法：10%水合氯醛麻醉下，分离并结扎左颈外动脉，动脉夹夹闭左颈总动脉近心端，于左颈总动脉远心端穿刺至左颈内动脉注射LPS（1 mg/kg，注射时间15 s，美国Sigma公司）。C组大鼠左颈内动脉注射等量生理盐水。注射LPS后即刻，PHC组大鼠腹腔注射PHC（2 mg/kg，成都力思特制药股份有限公司，批号H20020606），LPS组和C组大鼠腹腔注射与PHC等体积生理盐水，继续置笼饲养24 h后取材。
1.3大鼠脑皮质伊文氏蓝渗出观察
每组取3只大鼠进行脑皮质伊文氏蓝渗出观察。大鼠处死前1 h经左股静脉注射伊文氏蓝（3 mL/kg，20 g/L，购自美国Sigma公司，规格E2129-50G）。麻醉下快速断头处死，取左侧大脑皮质固定后冰冻切片，荧光显微镜下（632 nm）观察脑皮质伊文氏蓝渗出情况。
1.4大鼠脑组织中伊文氏蓝含量测定
每组取12只大鼠进行大鼠脑组织中伊文氏蓝含量测定。大鼠于处死前1 h经左股静脉注射伊文氏蓝（3 mL/kg，20 g/L）。麻醉下取左侧大脑皮质、海马称质量， 50 ℃水浴中孵育72 h，离心取上清液，检测伊文氏蓝含量（以μg/g脑组织表示）。
1.5TNF-α含量测定
采用ELISA法分别测定血清、脑脊液、脑组织中TNF-α含量，试剂盒均购自美国Sigma公司。每组取12只大鼠，麻醉下用1 mL注射器缓慢抽取脑脊液400 μL，同时经右颈动脉取血1.5 mL，离心后取上清-70 ℃保存备用。将大鼠麻醉下快速断头，取出完整脑组织，其中一半脑组织进行TNF-α含量测定，另一半进行含水量测定。
1.6脑组织含水量测定
大鼠剩余的一半脑组织称湿质量后，放入80 ℃烘箱内烘烤36 h至恒重，测干质量，计算脑组织含水量。
1.7统计学方法
应用spss 17.0统计学软件进行数据录入和统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，三组间比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1三组大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出情况
LPS组大鼠大脑皮质切片中有大量红色荧光物质（为渗出的伊文氏蓝染料）;与LPS组相比，PHC组大鼠大脑皮质切片中红色荧光物质明显减少;C组大鼠大脑皮质切片中未见明显红色荧光物质。见图1。
2.2三组大鼠脑组织伊文氏蓝含量和脑组织含水量比较
术后24 h，LPS组和PHC组大鼠左侧皮质、左侧海马伊文氏蓝质量分数和脑组织含水量均显著高于C组，差异有统计学意义;PHC组大鼠左侧大脑皮质、左侧海马伊文氏蓝质量分数和脑组织含水量低于LPS组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
3讨论
内毒素性脑损伤是重症感染患者的常见并发症，血脑屏障作为机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础，在内毒素性脑损伤中占有重要地位[5]。本结果显示，在注射LPS 24 h后，LPS组大鼠脑皮质切片中出现大量红色荧光物质，而C组大鼠脑皮质切片中未见红色荧光物质;此外，LPS组大鼠损侧皮质和海马区伊文氏蓝含量均显著高于C组大鼠，差异有统计学意义，定性和定量研究结果均提示LPS组大鼠脑组织中伊文氏蓝渗出量明显高于C组大鼠，这也进一步证实了内毒素性脑损伤可破坏血脑屏障的完整性，与Seok等[6]及Jangula和Murphy[7]在同源小鼠中的研究结果一致。
脑组织含水量是反映脑损伤的重要指标之一，内毒素性脑损伤后常发生血管源性脑水肿。本研究结果也显示，注射LPS 24 h后，LPS组大鼠脑组织含水量为84.5%，显著高于C组大鼠脑组织含水量的75.3%，差异有统计学意义。研究已显示，内毒素性脑损伤时，细胞膜通透性增加[8]，引起血管源性脑水肿，可导致神经元缺血缺氧、供能不足、代谢障碍，这些又进一步加重脑水肿，导致脑组织含水量增加。本研究结果也从另一方面证实内毒素性脑损伤可导致大鼠血脑屏障功能受损。 既往研究显示，TNF-α作为一种具有广泛生物学功能的炎症因子，可刺激单核原吞噬细胞产生IL-1、IL-8等细胞因子，加重内皮损伤;Nishioku等[9]研究结果显示，内毒素可刺激神经胶质细胞释放TNF-α，直接导致内皮细胞功能进一步减退，增加血管通透性。本研究结果也显示，在注射LPS 24 h后，LPS组大鼠不论血清、脑脊液还是脑组织中TNF-α含量均显著高于C组大鼠，差异均有统计学意义，这证实了TNF-α作为炎症因子，参与了内毒素性脑损伤后血脑屏障损伤的炎性机制，也提示抑制TNF-α表达，控制炎症反应，是内毒素性脑损伤治疗的途径之一。
最近研究表明，PHC能降低毛细血管壁的通透性，减少炎症时的渗出反应，对内毒素引起的肺损伤具有保护作用[3]。笔者在研究中也发现，PHC组大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出情况、渗出量以及脑组织含水量虽然高于C组大鼠，但却显著低于LPS组大鼠，说明内毒素注射后即刻注射PHC，可明显减少大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出和血管源性脑水肿，这提示PHC对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障损伤具有一定的保护作用。研究显示，PHC具有东莨菪碱等抗胆碱药类似的作用，可通过提高细胞对缺血缺氧的耐受性、稳定细胞膜及溶酶体和线粒体等细胞器的膜结构、减少溶酶体的释放和抑制花生四烯酸代谢产物的产生等途径发挥细胞保护作用，减轻血管源性脑水肿，这可以部分解释PHC对血脑屏障功能的改善原因。
此外，本研究结果还显示，PHC组大鼠不论血清、脑脊液还是脑组织中TNF-α含量均显著低于LPS组大鼠，差异均有统计学意义，这提示PHC还可能通过抑制机体炎症反应来改善内毒素性脑损伤后的血脑屏障功能。
总之，本研究结果显示，PHC可通过抑制机体炎症反应，有效改善内毒素性脑损伤大鼠血脑屏障功能，为临床治疗内毒素性脑损伤患者提供一定的理论依据。
参考文献
[1]Kujath P， Bouchard R， Shekarriz H， et al. Anticoagulation in the treatment of sepsis. Correction of microcirculation： a new approach manipulating endothelial cell function [J]. Chirurg， 2002， 73（11）： 1093-1099.
[2]Hack CE， Zeerleder S. The endothelium in sepsis： source of and a target for inflammation [J]. Crit Care Med， 2001， 29（7）： 21-27.
[3]周莉莉，黄子通，蒋龙元，等.盐酸戊乙奎醚对内毒素休克兔器官的保护作用[J].中华急诊医学杂志，2007，16（2）：143-146.
[4]曹慧灵， 但伶， 李炜. 异丙酚对大鼠内毒素性脑损伤的影响[J]. 中华麻醉学杂志， 2011， 31（5）： 623-623.
[5]何志捷，黄子通，邹子俊，等.心肺复苏大鼠脑组织基质金属蛋白酶与血脑屏障的变化及其抑制剂的作用[J].中华急诊医学杂志，2009，18（1）：17-21.
[6]Seok SM， Kim JM， Park TY， et al. Fructose-1，6-bisphosphate ameliorates lipopolysaccharide-induced dysfunction of blood-brain barrier[J]. Arch Pharm Res， 2013，36（9）：1149-1159.
[7]Jangula A， Murphy EJ. Lipopolysaccharide-induced blood brain barrier permeability is enhanced by alpha-synuclein expression[J]. Neurosci Lett，2013， 551：23-27.
[8]詹佳， 张宗泽， 陈畅王， 等. 盐酸戊乙奎醚对脂多糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中华急诊医学杂志，2011， 20（6）： 619-621.
[9]Nishioku T， Matsumoto J， Dohgu S， et al. Tumor necrosis factor-alpha mediates the blood-brain barrier dysfunction induced by activated microglia in mouse brain microvascular endothelial cells[J]. J Pharmacol Sci，2010，112（2）：251-254.
内毒素（lipopolysaccharide， LPS）性脑损伤是一种弥散性脑功能障碍[1]，全身炎症反应是引起内毒素性脑损伤可能原因之一[2]。盐酸戊乙奎醚（penhyclidine hydrochloride， PHC）为新型选择性抗胆碱能药物，具有中枢及外周抗毒蕈碱和抗烟碱样作用，能够通过血脑屏障进入脑内，减少炎症渗出反应[3]。目前关于PHC对内毒素性脑损伤的影响研究较少。本研究通过评价PHC对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障损害的保护作用，为临床治疗患者提供参考。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
清洁级成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠81只，体质量220～250 g，由山西省长治医学院实验动物中心提供。将81只大鼠按随机数字表分为3组，对照组（C组）、内毒素性脑损伤组（LPS组）和盐酸戊乙奎醚治疗组（PHC组），每组27只。所有操作遵循山西省长治医学院实验动物管理委员会相关规定。
1.2大鼠内毒素性脑损伤模型制备
LPS组和PHC组大鼠制备内毒素性脑损伤模型，制备方法参照文献[4]的方法：10%水合氯醛麻醉下，分离并结扎左颈外动脉，动脉夹夹闭左颈总动脉近心端，于左颈总动脉远心端穿刺至左颈内动脉注射LPS（1 mg/kg，注射时间15 s，美国Sigma公司）。C组大鼠左颈内动脉注射等量生理盐水。注射LPS后即刻，PHC组大鼠腹腔注射PHC（2 mg/kg，成都力思特制药股份有限公司，批号H20020606），LPS组和C组大鼠腹腔注射与PHC等体积生理盐水，继续置笼饲养24 h后取材。
1.3大鼠脑皮质伊文氏蓝渗出观察
每组取3只大鼠进行脑皮质伊文氏蓝渗出观察。大鼠处死前1 h经左股静脉注射伊文氏蓝（3 mL/kg，20 g/L，购自美国Sigma公司，规格E2129-50G）。麻醉下快速断头处死，取左侧大脑皮质固定后冰冻切片，荧光显微镜下（632 nm）观察脑皮质伊文氏蓝渗出情况。
1.4大鼠脑组织中伊文氏蓝含量测定
每组取12只大鼠进行大鼠脑组织中伊文氏蓝含量测定。大鼠于处死前1 h经左股静脉注射伊文氏蓝（3 mL/kg，20 g/L）。麻醉下取左侧大脑皮质、海马称质量， 50 ℃水浴中孵育72 h，离心取上清液，检测伊文氏蓝含量（以μg/g脑组织表示）。
1.5TNF-α含量测定
采用ELISA法分别测定血清、脑脊液、脑组织中TNF-α含量，试剂盒均购自美国Sigma公司。每组取12只大鼠，麻醉下用1 mL注射器缓慢抽取脑脊液400 μL，同时经右颈动脉取血1.5 mL，离心后取上清-70 ℃保存备用。将大鼠麻醉下快速断头，取出完整脑组织，其中一半脑组织进行TNF-α含量测定，另一半进行含水量测定。
1.6脑组织含水量测定
大鼠剩余的一半脑组织称湿质量后，放入80 ℃烘箱内烘烤36 h至恒重，测干质量，计算脑组织含水量。
1.7统计学方法
应用spss 17.0统计学软件进行数据录入和统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，三组间比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1三组大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出情况
LPS组大鼠大脑皮质切片中有大量红色荧光物质（为渗出的伊文氏蓝染料）;与LPS组相比，PHC组大鼠大脑皮质切片中红色荧光物质明显减少;C组大鼠大脑皮质切片中未见明显红色荧光物质。见图1。
2.2三组大鼠脑组织伊文氏蓝含量和脑组织含水量比较
术后24 h，LPS组和PHC组大鼠左侧皮质、左侧海马伊文氏蓝质量分数和脑组织含水量均显著高于C组，差异有统计学意义;PHC组大鼠左侧大脑皮质、左侧海马伊文氏蓝质量分数和脑组织含水量低于LPS组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
3讨论
内毒素性脑损伤是重症感染患者的常见并发症，血脑屏障作为机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础，在内毒素性脑损伤中占有重要地位[5]。本结果显示，在注射LPS 24 h后，LPS组大鼠脑皮质切片中出现大量红色荧光物质，而C组大鼠脑皮质切片中未见红色荧光物质;此外，LPS组大鼠损侧皮质和海马区伊文氏蓝含量均显著高于C组大鼠，差异有统计学意义，定性和定量研究结果均提示LPS组大鼠脑组织中伊文氏蓝渗出量明显高于C组大鼠，这也进一步证实了内毒素性脑损伤可破坏血脑屏障的完整性，与Seok等[6]及Jangula和Murphy[7]在同源小鼠中的研究结果一致。
脑组织含水量是反映脑损伤的重要指标之一，内毒素性脑损伤后常发生血管源性脑水肿。本研究结果也显示，注射LPS 24 h后，LPS组大鼠脑组织含水量为84.5%，显著高于C组大鼠脑组织含水量的75.3%，差异有统计学意义。研究已显示，内毒素性脑损伤时，细胞膜通透性增加[8]，引起血管源性脑水肿，可导致神经元缺血缺氧、供能不足、代谢障碍，这些又进一步加重脑水肿，导致脑组织含水量增加。本研究结果也从另一方面证实内毒素性脑损伤可导致大鼠血脑屏障功能受损。 既往研究显示，TNF-α作为一种具有广泛生物学功能的炎症因子，可刺激单核原吞噬细胞产生IL-1、IL-8等细胞因子，加重内皮损伤;Nishioku等[9]研究结果显示，内毒素可刺激神经胶质细胞释放TNF-α，直接导致内皮细胞功能进一步减退，增加血管通透性。本研究结果也显示，在注射LPS 24 h后，LPS组大鼠不论血清、脑脊液还是脑组织中TNF-α含量均显著高于C组大鼠，差异均有统计学意义，这证实了TNF-α作为炎症因子，参与了内毒素性脑损伤后血脑屏障损伤的炎性机制，也提示抑制TNF-α表达，控制炎症反应，是内毒素性脑损伤治疗的途径之一。
最近研究表明，PHC能降低毛细血管壁的通透性，减少炎症时的渗出反应，对内毒素引起的肺损伤具有保护作用[3]。笔者在研究中也发现，PHC组大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出情况、渗出量以及脑组织含水量虽然高于C组大鼠，但却显著低于LPS组大鼠，说明内毒素注射后即刻注射PHC，可明显减少大鼠大脑皮质伊文氏蓝渗出和血管源性脑水肿，这提示PHC对大鼠内毒素性脑损伤后血脑屏障损伤具有一定的保护作用。研究显示，PHC具有东莨菪碱等抗胆碱药类似的作用，可通过提高细胞对缺血缺氧的耐受性、稳定细胞膜及溶酶体和线粒体等细胞器的膜结构、减少溶酶体的释放和抑制花生四烯酸代谢产物的产生等途径发挥细胞保护作用，减轻血管源性脑水肿，这可以部分解释PHC对血脑屏障功能的改善原因。
此外，本研究结果还显示，PHC组大鼠不论血清、脑脊液还是脑组织中TNF-α含量均显著低于LPS组大鼠，差异均有统计学意义，这提示PHC还可能通过抑制机体炎症反应来改善内毒素性脑损伤后的血脑屏障功能。
总之，本研究结果显示，PHC可通过抑制机体炎症反应，有效改善内毒素性脑损伤大鼠血脑屏障功能，为临床治疗内毒素性脑损伤患者提供一定的理论依据。
参考文献
[1]Kujath P， Bouchard R， Shekarriz H， et al. Anticoagulation in the treatment of sepsis. Correction of microcirculation： a new approach manipulating endothelial cell function [J]. Chirurg， 2002， 73（11）： 1093-1099.
[2]Hack CE， Zeerleder S. The endothelium in sepsis： source of and a target for inflammation [J]. Crit Care Med， 2001， 29（7）： 21-27.
[3]周莉莉，黄子通，蒋龙元，等.盐酸戊乙奎醚对内毒素休克兔器官的保护作用[J].中华急诊医学杂志，2007，16（2）：143-146.
[4]曹慧灵， 但伶， 李炜. 异丙酚对大鼠内毒素性脑损伤的影响[J]. 中华麻醉学杂志， 2011， 31（5）： 623-623.
[5]何志捷，黄子通，邹子俊，等.心肺复苏大鼠脑组织基质金属蛋白酶与血脑屏障的变化及其抑制剂的作用[J].中华急诊医学杂志，2009，18（1）：17-21.
[6]Seok SM， Kim JM， Park TY， et al. Fructose-1，6-bisphosphate ameliorates lipopolysaccharide-induced dysfunction of blood-brain barrier[J]. Arch Pharm Res， 2013，36（9）：1149-1159.
[7]Jangula A， Murphy EJ. Lipopolysaccharide-induced blood brain barrier permeability is enhanced by alpha-synuclein expression[J]. Neurosci Lett，2013， 551：23-27.
[8]詹佳， 张宗泽， 陈畅王， 等. 盐酸戊乙奎醚对脂多糖诱导的内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中华急诊医学杂志，2011， 20（6）： 619-621.
[9]Nishioku T， Matsumoto J， Dohgu S， et al. Tumor necrosis factor-alpha mediates the blood-brain barrier dysfunction induced by activated microglia in mouse brain microvascular endothelial cells[J]. J Pharmacol Sci，2010，112（2）：251-254.