分析基质金属蛋白酶及其抑制因子联合检测对宫颈癌复发的预测价值

游 泳1杜莹莹1曹 媛2李真珍2张胜军2

1.郑州大学第一附属医院妇产科，河南郑州 450052；2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州 450052

[摘要] 目的 分析联合检测基质金属蛋白酶及其抑制因子联预测宫颈癌复发的价值。方法 选取宫颈癌首次术后的标本118份，分为复发组48例和未复发组70例。采用SABC法行免疫组化检测标本MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2因子阳性表达率和表达强度。同时，选取同期正常宫颈组织标本30例为对照组。比较各组相关因子表达情况差异。结果 复发组中MMP-2和MMP-9的阳性率(81.3%和79.2%)和表达强度(99.86±23.67和97.53±23.14)显著高于未复发组(48.6%和51.4%，69.75±15.86和72.16±16.01)和对照组(10.0%和6.7%，28.12±9.48和33.97±11.14)，TIMP-1和TIMP-2的阳性率(39.6%和43.8%)和表达强度(60.48±14.03和62.75±14.63)显著低于为未复发组(68.6%和71.4%，84.93±19.86和88.86±20.15)和对照组(90.0%和93.3%，105.62±24.24和108.74±24.87) (P<0.05)。未复发组中MMP-2和MMP-9的阳性率和表达强度显著高于对照组，TIMP-1和TIMP-2的阳性率和表达强度显著低于对照组(P<0.05)。结论 MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1、TIMP-2联合检测可作为评估宫颈癌复发的重要指标。

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关键词 宫颈癌；基质金属蛋白酶；复发；基质金属蛋白酶组织抑制物

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）07（c）－０021-03

[基金项目] 国家自然科学青年基金(U1304803)；河南省教育厅科学技术研究重点项目（12A320067）。

[作者简介] 游泳，女，硕士，副主任医师，研究方向：女性生殖系统肿瘤的诊断和治疗。

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一。目前，以手术、放疗和化疗为主的多种手段用于宫颈癌的额治疗和预防其复发，但其复发率仍较高[1]。目前，如何有效预测宫颈癌复发为女性恶性肿瘤研究丞待解决的课题。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)是一种蛋白水解酶，其主要作用为降解细胞外基质，在肿瘤的发生、侵袭转移中发挥重要作用，其抑制物(tissu inhibitor of matrix metalloproteinase， TIMPs)与MMPs结合，特异性抑制MMPs活性[2]。目前，已有文献对MMPs/TIMPs在宫颈癌中的表达情况进行报道[3]，但有关MMPs和TIMPs联合检测对宫颈癌复发的预测价值的研究较少。该研究选取2005年3月—2011年2月间该院收治的宫颈癌患者118例，分析了复发宫颈癌患者MMP-2、MMP-9及其抑制剂TIMP-2、TIMP-1表达情况，旨在探讨MMPs和TIMPs联合检测对宫颈癌复发的预测价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院诊治的宫颈癌患者首次术后病理标本118份。根据术后随访情况（3年内疾病是否复发），将患者分为复发组和未复发组。复发组48例：年龄35～75(61.5±6.06)岁；肿瘤大小0.5～7.6(3.4±1.4)cm；组织学分级：G1 7例、G2 13例、G3 28例；FIGO标准分期：Ⅰ期13例、Ⅱ期35例；组织学类型：鳞癌41例、腺癌7例。未复发组70例：年龄33～74(60.2±6.13)岁；肿瘤大小0.5～6.9(3.2±1.3)cm；组织学分级：G1 12例、G2 20例、G3 38例；FIGO标准分期：Ⅰ期21例、Ⅱ期49例；组织学类型：鳞癌57例、腺癌13例。同时，选取正常宫颈组织标本30例为对照组，年龄32～65(53.5±5.1)岁。所有患者术前均未接受过化疗、免疫、冷冻、放疗和激光等治疗，所有标本均经病理学确诊。复发组和未复发组患者在年龄、肿瘤大小、分期、分级和组织类型方面差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 即用型鼠抗人TIMP-2和TIMP-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；HIGH-SABC试剂盒；即用型鼠抗人MMP-2和MMP-9免疫组化试剂盒；DAB显色试剂盒。

1.2.2 实验方法 各组患者组织标本均采用SABC法进行免疫组化检测，操作严格按照试剂盒说明书进行。取两组患者病变组织标本1份；对照组任取宫颈组织1份。经甲醛固定、脱水、石蜡包埋处理。厚度4 μm连续定向切片，处理后用于免疫组化染色和HE染色。主要步骤[4]：①脱蜡、水化、PBS洗涤；②蒸馏水洗涤、抗原修复、PBS洗涤；③滴加山羊血清，室温20 min；④滴加Ⅰ抗，室温60 min，PBS洗涤；⑤滴加Ⅱ抗，25 ℃ 20 min，PBS洗涤；⑥滴加SABC试剂，25 ℃ 20 min，PBS洗涤；⑦DAB显色，蒸馏水洗涤；⑧脱水、透明、封片。用已知的免疫组化染色阳性的宫颈切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲盐液代替一抗作阴性对照。

1.2.3 结果判定 由两位医师观察切片后共同判断；阳性表达：以细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒沉着为阳性。采用上海山富科学仪器有限公司提供的Biosens Digital Imaging System v1.6自动分析系统，测量切片肿瘤细胞阳性成分的平均吸光度代表其表达强度。

1.2.4 参数记录和比较 记录每份组织免疫组化检测结果，统计各个因子(MMP-2、MMP-9、TIMP-2和TIMP-1) 阳性表达率和表达强度。比较各组相关因子表达情况。

1.3 统计方法

应用spss 13.0软件对研究数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用的统计学方法为单因素方差分析；计数资料以百分比表示，采用的统计学方法为χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组MMP-2和MMP-9的表达情况

与未复发组和对照组相比，复发组患者MMP-2和MMP-9的阳性表达率和表达强度显著增高(P<0.05)；与对照组相比，未复发组患者MMP-2和MMP-9的阳性表达率和表达强度显著增高(P<0.05)。见表1、表2。

2.2 各组TIMP-2和TIMP-1的表达情况

与未复发组和对照组相比，复发组中TIMP-2和TIMP-1的阳性表达率和表达强度显著降低(P<0.05)；与对照组相比，未复发组TIMP-2和TIMP-1的阳性表达率和表达强度显著降低(P<0.05)。见表1、表2。

3 讨论

宫颈癌是女性恶性肿瘤死亡的主要原因之一，术后复发率较高，预后较差。改善恶性肿瘤患者预后的关键为早期发现、及时采取有效治疗[5]；如何有效预测宫颈癌的复发对判断预后具有重要的意义。目前，可有效预测宫颈癌复发的生物学指标仍在探索之中。

MMPs是一种可降解细胞外基质和基底膜的蛋白水解酶，其在诱导肿瘤浸润、转移和复发中发挥关键作用。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成员中降解作用较强的两种亚型。Huang等[6]报道称，卵巢上皮细胞癌组织中的MMP-2和MMP-9蛋白的高表达与癌细胞的侵袭能力呈正相关。李婵玉等[7]研究发现，宫颈癌患者MMP-9阳性表达率显著高于宫颈慢性炎症患者，其认为MMP-9高表达可能与宫颈癌的发生有关。该研究发现，复发组患者MMP-2和MMP-9的阳性率(81.3%和79.2%)和表达强度[(99.86±23.67）和（97.53±23.14)]、未复发组MMP-2和MMP-9的阳性率(48.6%和51.4%)和表达强度(69.75±15.86和72.16±16.01)显著高于对照组(10.0%和6.7%，28.12±9.48和33.97±11.14)，与上述研究相似，提示MMP-2和MMP-9高表达可能与宫颈癌的发生、发展有关。孙晓彤等[8]研究发现，复发子宫颈癌患者MMP-9蛋白阳性率显著高于未复发患者，其认为检测MMP-9蛋白可能有利于预测宫颈癌患者术后的复发，但其并未对MMPs家族的其它亚型进行检测。本研究证实，复发组患者MMP-2和MMP-9的阳性率和表达强度显著高于对照组和未复发组，说明MMP-2和MMP-9高表达可能参与宫颈癌的复发。其原因可能为：MMPs降解细胞外基质、破坏基底膜屏障及局部的组织结构，使肿瘤细胞浸润周围组织，发生淋巴等远处转移，为肿瘤复发提供可能；同时MMPs具有促进新生血管形成的作用，为肿瘤细胞的复发提供条件。

TIMPs是体内MMPs的天然抑制物，与MMPs特异性结合抑制其活性，二者共同参与机体多种生理病理变化。黄静仪等[9]报道称，TIMP-1和TIMP-2低表达与肿瘤的侵袭和转移密切有关。李芳等[10]研究显示，TIMP-1和TIMP-2在宫颈鳞癌中的表达明显低于慢性宫颈炎。该研究发现，复发组患者TIMP-1和TIMP-2的阳性率(39.6%和43.8%)和表达强度[(60.48±14.03）和（62.75±14.63)]、未复发组患者TIMP-1和TIMP-2的阳性率(68.6%和71.4%)和表达强度[(84.93±19.86）和（88.86±20.15)]显著低于对照组(90.0%和93.3%，[（105.62±24.24）和（108.74±24.87)]，提示TIMP-1和TIMP-2低表达可能与宫颈癌的发生、发展有关。孙其恺等[11]报道称，TIMP-2在肝癌的侵袭转移和复发过程中起重要作用，其可作为肝癌术后预后预测的指标。而彭挺生等[12]报道称，骨肉瘤术后是否复发与TIMP-1、TIMP-2表达情况无关。TIMP-1、TIMP-2表达情况与肿瘤复发关系目前仍有争议，而有关TIMP-1和TIMP-2表达情况与宫颈癌复发关系鲜有文献报道。本研究对此进行了初步的分析，发现复发组患者TIMP-1和TIMP-2的阳性率和表达强度显著低于对照组和未复发组，说明TIMP-1和TIMP-2低表达可能与宫颈癌的复发有关。其原因可能为：TIMPs在组织中表达降低，其对MMPs的抑制作用减弱，MMPs对ECM的降解作用得到增加，促进了肿瘤细胞的浸润和转移，为肿瘤的复发提供可能。

综上，MMP-2、MMP-9及其抑制剂TIMP-2、TIMP-1表达情况可能与宫颈癌的发生、发展相关，其可作为评估宫颈癌复发的重要指标。有关MMPs和TIMPs在宫颈癌复发中的作用及其机制仍需进一步研究。

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参考文献

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（收稿日期：2014-04-24）