烟草不育系与保持系线粒体DNA的重测序研究

　　摘 要：基于重测序技术，对两对不育系和对应的保持系材料的线粒体DNA进行重测序，统计并分析了不育系与保持系线粒体DNA编码区序列的突变位点，探讨了这些突变位点与烟草胞质不育的关系。对重测序结果比对分析可知：不育系和保持系在orf106b上具有一致的1个InDel位点，在orf138a、orf121b、orf129b和orf110b上具有一致的SNP位点，这些突变位点没有造成不育系与保持系编码区序列的差异，推测这些突变位点可能与CMS无关；不育系MSK326和MSK394在orf112a和orf103c上有相同的InDel位点；MSK326和MSK394在65个基因片段或开放阅读框上有一致SNP位点，且这些突变没有出现在保持系线粒体编码区。这些基因片段或开放阅读框上的InDel和SNP突变都导致了基因或开放阅读框编码序列的改变，并且造成了氨基酸的突变，推测可能与烟草CMS密切的相关。其中atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf25、nad6、nad7、orf108、orf239、orf129、sdh4等基因或开放阅读框上的突变位点与报道研究一致，均被报道与烟草CMS存在密切的联系。本研究所挖掘的这些大量基因片段上的InDel和SNP位点，不仅有助于烟草CMS机理的进一步研究，也为烟草不育系育种研究提供有力的遗传工具。 

　　关键词：烟草；线粒体DNA；重测序 

　　重测序是指对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。在全基因组水平上扫描并检测与重要性状相关的基因序列差异和结构变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因预测。由于其具有检测全面、真实可靠、快速容易等优点，受到越来越多的关注。目前，国内外学者将基因组重测序广泛运用在水稻、拟南芥、黄瓜、油菜等物种中，成功定位了黄瓜早花基因、水稻抗稻瘟病、不育性等基因。但是在烟草不育机理的研究中，仍然以通过SSR和RAPD标记以及基因克隆等分子技术为主，重测序技术在烟草不育机理研究中应用较少。 

　　烟草雄性不育的形成十分复杂，目前广泛认为是控制雄性不育性的遗传物质发生了变异，导致烟株体内生理生化过程的改变，促使烟株细胞形态发生变化，从而形成雄性不育[1]。大量研究表明烟草雄性不育是细胞质与细胞核共同调节的结果，但主要是线粒体DNA上发生的一些变异或者缺失，导致线粒体功能遭到破坏而发生紊乱，花粉不能正常发育，造成花丝缩短、花粉囊枯皱等现象[2-3]，从而引起烟草雄性不育，即细胞质雄性不育（CMS）[4]。Nair认为胞质雄性不育性的遗传因子位于线粒体基因组[5]。Bergman等[6]发现不育系线粒体基因atp1同orf274共转录本升高导致其ATP/ADP比率显著降低是该不育类型不育的一个特点。赵婷等[7]和朱腾义等[8]分别获得了不育系存在显著相关性的atp6和coxII 基因 SNP 位点。刘齐元等[9]发现不育系和保持系线粒体基因组有明显的差异，但是对胞质不育类型的烟草雄性不育分子机理尚未展开研究。 

　　通过线粒体DNA重测序技术，对比分析不育系与保持系的线粒体DNA序列差异，得到与烟草雄性不育相关的SNP位点，以及系统的挖掘与烟草雄性不育形成相关的基因，为揭示烟草细胞质雄性不育的分子机理奠定实验依据。对积极选育烟草雄性不育系，开辟烟草杂种优势利用的新前景有其重要的实际意义。 

　　1 材料和方法 

　　1.1 试验材料 

　　试验在湖南农业大学中南烟草实验基地进行。以保持系K326、不育系MSK326、保持系K394和不育系MSK394等烤烟品种为材料，两对材料是严格的同核异质材料。 

　　1.2 试验设计 

　　试验材料于2015年12月26日播种，采用漂浮育苗。成苗后，对材料进行遮光处理培养。选取长势一致的黄化苗制备线粒体DNA。将制备好的符合要求的DNA样品送测序公司重测序检测。 

　　1.3 mtDNA的制备 

　　参考李文强等[10]和李凤霞等[11]方法，改进GENMED公司高多糖/酚植物线粒体DNA萃取试剂盒提取方法制备本试验材料线粒体DNA。 

　　1.4 mtDNA的质量及纯度检测 

　　取7.5 L mtDNA样品与1.5 μL 6×loading buffer用稳压电泳仪在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。运用凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司）拍照保存。取1 μL mtDNA溶液，加超纯水稀释至100 μL，用Eppendorf BioOhotometer分光光度计测出A260/A280、A260/A230 及mtDNA浓度。将检测符合的线粒体DNA送诺禾致源生物技术公司重测序。 

　　1.5 数据处理与分析 

　　分析得到的重测序结果，采用Excel2003和SPSS软件进行。 

　　2 结果与分析 

　　2.1 烟草线粒体DNA的制备和检测 

　　2.1.1 烟草线粒体DNA琼脂糖凝胶电泳检测 通过差速离心的方法，获得烟草线粒体，然后使用线粒体DNA萃取试剂盒提取的线粒体DNA样品，对样品进行电泳检测。由图1可知样品均条带整齐、清楚，无拖尾现象，表明mtDNA纯度较高，没有发生降解，能够满足后续试验的要求。 

　　2.1.2 紫外分光光度法检测烟草线粒体DNA纯度 纯净的DNA的OD260/230应该大于2。当OD260/230小于2，表明溶液中有残留的盐类杂质及其他小分子物质。纯净的DNA的OD260/280为1.8。当OD260/280>1.9，表明溶液中有RNA污染；当OD260/280<1.6，表明溶液中有蛋白质、酚类等污染。 

　　从表1可以看出，所有的样品OD260/230在1.97～2.10之间，OD260/280在1.85～1.92之间，表明提取的DNA纯度较高，几乎没有RNA污染，无蛋白质、酚类及其他盐类物质污染，符合重测序要求。 

　　2.2 不育系与保持系线粒体DNA重测序比较分析 

　　2.2.1 不育系与保持系线粒体DNA的InDel和SNP统计与分析 InDel 是指基因组中小片段的插入和缺失序列。SNP（单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。图2和图3分别是各样品的InDel和SNP统计结果。由图2可知不育系MSK326的InDel个数为62个，高于保持系K326的12个；其中不育系MSK326中纯合InDel个数为43，杂合InDel为19个；且其中插入类型为28个，缺失类型为34个。MSK394的InDel为70个，高于保持系K394的22个。其中不育系MSK394纯合InDel和杂合InDel均为35个；且其中插入类型为31个，缺失类型为39个。图3可知不育系MSK326和MSK394的SNP个数分别为770和766，高于保持系K326和K394的189和199；其中不育系MSK326中纯合SNP个数为390，杂合SNP为380个；其中转换类型为307个，颠换类型为463个，ts/tv为0.66，低于保持系K326的1.39。不育系MSK394纯合SNP个数为341，杂合SNP为425个；且其中转换类型为322个，颠换类型为444个，ts/tv为0.73，低于保持系K394的1.21。

　　2.2.2 不育系与保持系线粒体DNA的INDel分析 由表3可知保持系K326在编码区的InDel只有一个，K394有两个InDel存在；不育系MSK326的InDel有4个，MSK326有8个。三个样品都在orf106b的177801位点存在缺失，且都是缺少了G碱基。不育系MSK326和MSK394存在两个完全一致的InDel；orf112a的19845位点都存在缺失，且都是缺失碱基AAAAAGA；orf103c的227978位点都存在缺失，且都是缺失碱基CCTTAGAGTCAAGTGGCTTTCAGCTCCTCT。这两个相同的InDel在保持系上不存在。不育系与保持系在这两个基因上的序列不一致，有可能导致了编码区的密码子的变化，从而导致了氨基酸改变，推测可能与烟草CMS存在联系。而orf106b 的177801位置上的缺失在K326，K494和MSK394中均有出现，但在MSK326中没有，推测可能与CMS无必然联系。 

　　2.2.3 不育系与保持系线粒体DNA的SNP位点分析 由表4可知，orf138a、orf121b、orf129b上只在MSK394和K394存在一个相同位点的突变，K326和MSK326未出现；orf110b上MSk326和K326都存在一个相同位点的突变，K394和MSK394没有。可推测这些只存在于各自不育系与相应保持系的突变位点可能与各自的某些不同性状有关，与烟草雄性不育机理无关。只有K394在orf297a、orf121c上存在突变位点，而orf105a上只有K326存在突变位点。orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因虽然不育系上都存在突变位点，但是不育系材料的碱基序列与保持系材料一致；且在不育系材料中nad1和nad2虽然碱基发生了突变，但并未造成编码的氨基酸改变，推测这些基因与CMS之间可能无必然联系。不育系在nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf25、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、orf214、orf103b、orf119b、orf306、orf114a、orf147、orf166a、orf118、orf144、orf107、orf190、orf111c、cox3、orf125e、orf274、trnM、orf131b、orf202、nad6、rps4、ccmB、orf125g和orf141上均发生了突变，其中不育系MSK3426和MSK394在ccmC上有相同突变位点有10个，atp6上有5个，orf239上有11个，orf147有4个，orf274有7个，且这些突变没有发生在保持系上或者与保持系突变位点不同。这些突变导致了不育系与保持系编码区序列的差异，也改变了不育系上相关基因的编码序列，造成了密码子的改变，从而导致了氨基酸改变，影响了有关蛋白质的合成。推测这些差异突变可能与烟草CMS存在联系。 

　　2.2.4 SNP位点基因注释以及与烟草不育相关性分析 atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf25、orf239、orf129、sdh4等基因上出现的突变位点与前人研究报道一致，且目前已有这些基因上的SNP突变被证实与烟草CMS有关。其中atp1[12]、atp4[13]、atp6、atp9[14]都有过相关研究报道，这些基因都与ATP合酶的正常功能的发挥密切相关（表5）。ATP合酶是线粒体进行氧化磷酸化过程的关键酶。花粉发育是一个高耗能的过程，若某个或某些基因产物干扰了线粒体F0F1-ATP合成酶的功能，将可能导致花粉的败育。Ashutosh等[15]研究发现，在带有Moricandia arvensis胞质的芥菜中，线粒体基因上的orf 108与雄性不育有关；Yamamoto等[16]发现，orf129特异存在于甜菜CMS中。He S等[17]将嵌合基因ORF239转入烟草核基因组，烟草花粉败育，表明orf239与烟草雄性不育有关。张长静等[18]研究表明不育系的sdh4基因第28位碱基发生了改变；以致其编码蛋白改变，这极可能成为干扰线粒体琥珀酸脱氢酶亚基3功能的关键因素，从而成为可能导致烟草CMS的根本原因之一。 

　　3 结论与讨论 

　　3.1 结 论 

　　不育系MSK326和MSK394线粒体DNA序列上出现的InDel和SNP远远高于保持系K326和K394。这些基因组中小片段的插入和缺失核苷酸的变异影响了DNA序列上碱基的变化，改变了原来的密码子，导致氨基酸变化，很可能与物种的某些性状的出现有关。与保持系线粒体DNA相比，不育系线粒体DNA在orf112a和orf103c的相同位点上均出现了相同的碱基缺失，导致了不育系与保持系orf112a和orf103c上编码序列的差异。目前还没有出现过orf112a和orf103c与CMS相关的研究报道，但并不能否认orf112a和orf103c上的缺失就与烟草雄性不育的形成无关。 

　　不育系在orf138a、orf121b、orf129b、orf110b、orf297a、orf121c、orf105a、orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因上都存在突变位点，但在保持系上同样出现了相同的突变，导致不育系材料的碱基序列与保持系材料一致。且不育系材料中nad1和nad2虽然碱基发生了突变，但并未造成编码的氨基酸改变，推测这些基因上的突变与CMS之间可能无必然联系。不育系在线粒体DNA上的nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、cox3、trnM、nad6、ccmB等均发生了突变，导致了不育系与保持系在编码区序列的差异，并且碱基的改变造成了氨基酸的突变，推测可能与烟草CMS存在密切的联系。其中ccmC，atp6，orf239，orf147，orf274等上突变位点较多。 

　　目前，已有atp1、atp4、atp6、coxl、orf25、cox3、atp9、orf108、orf239、orf129、sdh4基因上的SNP可能与CMS相关已经被证实。其他基因上的SNP突变是否与CMS相关少有报道，有待于进一步研究。 

　　3.2 讨 论 

　　烟草线粒体DNA的提取关键在于获得高纯度且完整的线粒体DNA。由于烟草既有细胞壁、液泡和叶绿体DNA等多种物质的干扰，又含高糖高酚；分离提取线粒体DNA的难度较大。经过对比实验后，根据线粒体试剂盒方法，改进普通线粒体提取方法，得到的mtDNA电泳条带清晰、无污染。使用幼嫩的黄化草叶片，容易使烟草组织破碎，提高了mtDNA的产率，也一定程度避免了叶绿体DNA的影响。 

　　通过高通量重测序技术，挖掘的大量的InDel和SNP位点，其中不少SNP同时发生在不育系与保持系上，且突变位置相同。虽然这些SNP与烟草的不育机理无关，但是这些SNP是否与样品的某些其它性状有关。这些SNP的挖掘有助于进一步对K326和K394品种进行研究。结合前人的研究报道以及分子信息学的研究，那些导致不育系和保持系序列差异的SNP突变有一部分被证实与烟草CMS形成密切相关，如tp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf239、orf25、orf129、sdh4等。为揭示烟草细胞质雄性不育分子机理提供了直接的分子依据，也为进一步为创造新的不育性品种提供了可能。但还有大量的SNP位点与烟草雄性不育的相关性有待于进一步验证，有助于进一步探究烟草雄性不育的形成机理。 

　　参考文献： 

　　[1] 烟草育种学 杨铁钊[M].北京：中国农业出版社，2003：88-90. 

　　[2]BERGMAN P，EDQVIST J，FARBOS I，et al.Male-sterile tobacco displays abnormal mitochondrial atp1 transcript accumulation and reduced floral ATP/ADP ratio[J].Plant Molecular Biology，2000，42（3）：531-544. 

　　[3]HE S C，ABAD A R，GELVIN S B，et al.A cytoplasmic male sterility-associated mitochondrial protein causes pollen disruption in transgenic tobacco[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（21）：11763-11768. 

　　[4]BUDAR F，PELLETIER G.Male sterility in plants： occurrence， determinism， significance and use[J].COMPTES RENDUS DE L ACADEMIE DES SCIENCES SERIE III-SCIENCES DE LA VIE-LIFE SCIENCES，2001，324（6）：543-550. 

　　[5]刘齐元，刘飞虎，何宽信，等.烟草雄性不育的分子机理研究进展[J].江西农业科学，2003，25（4）：514-518. 

　　[6]胡滨，陈观平，施农农，等. 植物细胞质雄性不育及其在育种中的应用[J]. 浙江林学院学报，2006，23（6）：689-693. 

　　[7]赵婷，朱滕义，刘齐元，等.烟草线粒体基因atp6的SNP及其与CMS的相关性[J].作物学报，2009，35（9）：1655-1661. 

　　[8]朱滕义，范东东，赵婷，等.烟草线粒体基因coxⅡ的SNP检测及其与CMS的相关性分析[J].核农学报，2010，24（4）：720-727. 

　　[9]刘齐元，刘飞虎，黄海泉，等.烟草胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的RAPD分析[J].江西农业大学学报，2005，27（6）：826-830. 

　　[10]李文强，张改生，汪奎，等.小麦线粒体DNA的高效提取方法[J].遗传，2007，29（6）：771-775. 

　　[11] 李风霞，杨爱国，崔萌萌，等. 四种细胞质来源的烟草不育系线粒体SSR位点差异[J].作物学报， 2011，37（12）： 2285-2292. 

　　[12]BERGMAN P，EDQVIST J，FARBOS I，et al.Male-sterile tobacco displays abnormal mitochondrial atp1 transcript accumulation and reduced floral ATP/ADP ratio[J].Plant Molecular Biology，2000，42（3）：531-544. 

　　[13]刘齐元，朱滕义，赵婷，等.异常线粒体基因ORF 25可能导致烟草雄性不育[J].江西农业大学学报，2009，31（1）：54-62. 

　　[14] Gómez-Casati D F， Busi M V， Gonzalez-Schain N， et al. A mitochondrial dysfunction induces the expression of nuclear-encoded complex I genes in engineered male sterile Arabidopsis thaliana [J]. FEBS Letters， 2002， 532： 70-74. 

　　[15]ASHUTOSH，KUMAR P，KUMAR V D，et al.Sharma，shyam prakash and shripad R.Bhat.A novel orf 108 Co 2transcribed with the atpA gene is associated with cyto-plasmic male sterility in brassica juncea carrying moricandia arvensis cytoplasm[J].Plant & cell physiology，2008，49（2）：284-289. 

　　[16]YAMAMOTO M P，SHINADA H，ONODERA Y A，et al.A male sterility-associated mitochondrial protein in wild beets causes pollen disruption in transgenic plants[J].Plant Journal，2008，54（6）：1027-1036. 

　　[17] HE S， ABAD A R， GELVIN S B， et al. A cytoplasmic male sterility-associated mitochordrical protein causes pollen dis-ruption in transgenic tobacco[J] . Proc Natl Acad Sci USA，1996， 93： 11 763 - 11 768. 

　　[18] 张长静，李风霞，贾兴华，等.烟草细胞质雄性不育线粒体基因sdh3和sdh4的生物信息学分析[J].中国烟草科学， 2013，34（3）： 42-48.