金银花尺蠖幼虫血细胞形态观察
2022-06-09
摘要：运用Wright’s-Giemsa’s染色和光学显微镜对金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）幼虫血细胞的形态进行观察，发现金银花尺蠖幼虫血淋巴中有原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛血胞和囊血胞6 种类型的血细胞。
关键词：金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）；血细胞；形态观察
中图分类号：Q969.93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4052-04
Morphological Observation on Larva Hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.
XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng
（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China）
Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.
Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.； hemocytes；morphous observation
昆虫是动物界中最大的类群，在长期进化的过程中形成了一套复杂的免疫系统，对入侵的病原体具有识别和清除能力，主要包括体液免疫和细胞免疫应答[1，2]。血细胞是昆虫细胞免疫的主要执行者，在抵抗病原体入侵的免疫应答过程中发挥着重要作用。昆虫种类不同，参与细胞免疫的血细胞种类不同[3]，血细胞的某些生理机能变化常常表现为细胞形态和组成的变化。因此，研究昆虫血细胞形态分类对深入揭示其细胞免疫功能具有重要推动作用。自1669年Swammerdam首次发现昆虫的“白”血细胞以来[4，5]，人们对昆虫血细胞的研究已有 340多年的历史，涉及蚊（Culicidae）、蝇（Muscidae）、 蚋（Simuliidae）、蜚蠊（Blattaria）、蚕（Bombyx mori）、粘虫[Mythimna separata（Walker）]等100多种昆虫[6，7]。由于昆虫种类繁多，其血细胞形态各异，甚至同一种昆虫不同虫态、虫龄在不同生态、生理条件下的血细胞形态也存在显著差异。昆虫血细胞的分类比较复杂，存在的分歧很多[8]。因此，应对更多种类的昆虫血细胞形态进行研究，以丰富其形态分类。
金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）是近年来新发现的为害金银花的食叶害虫之一，该虫为鳞翅目尺蛾科昆虫，别名拱腰虫，在安徽省1年发生3代[9]，常将叶片咬成缺刻或孔洞，危害严重的地块金银花叶片被全部吃光，仅剩叶脉和叶柄，常造成金银花大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失。目前，国内对金银花尺蠖的研究主要集中在生物学特性及防治方面[9-13]，对其血细胞的形态学研究尚未见报道。本研究对金银花尺蠖幼虫血细胞形态进行观察，以期为金银花尺蠖幼虫血细胞分类和细胞免疫研究提供试验依据， 同时也为金银花尺蠖的防治提供新途径。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
从滁州市郊三界镇野生金银花上采集金银花尺蠖幼虫，带回实验室于人工气候箱（RXZ-288A型，宁波江南仪器制造厂）中用新鲜的金银花叶片饲养多代，选取老熟幼虫备用。人工气候箱光周期（L∶D）为14 h∶10 h，温度为（25±1） ℃，相对湿度为（70±7）%。
1.2 试剂
Wright’s染料（Sigma公司）、Giemsa染料（德国AppliChem公司）、磷酸二氢钾（广东西陇化工股份有限公司）、磷酸氢二钠（广东西陇化工股份有限公司）、甘油（无锡市晶科化工有限公司）、甲醇（上海凌峰化学试剂有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 染液配制 Wright’s染液：称取Wright’s染料粉末0.1 g放在研钵内，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干净的棕色玻璃瓶中，在室温条件下密封保存，7 d后即可使用。
Giemsa染液：称取Giemsa粉0.75 g放入研钵中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中搅拌加热90 min，溶入50 mL甲醇中，摇匀后置于37 ℃恒温箱内保温8～12 h，过滤后置于棕色瓶中密封保存，即为Giemsa原液，12 h后即可使用。临用时，取1 mL Giemsa原液与10 mL PBS（pH 6.8）混合。
1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸缓冲液（PBS）
pH 6.8：称取磷酸氢二钠0.47 g，磷酸二氢钾0.46 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。
pH 7.2：称取磷酸氢二钠0.68 g，磷酸二氢钾0.25 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。
1.3.3 涂片与观察 取金银花尺蠖老熟幼虫10头，用无菌水清洗后擦干，用解剖针将其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在载玻片上涂成血膜，先用Wright’s染液将血膜面充分覆盖，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再缓慢地一滴一滴加磷酸盐缓冲液（pH 7.2），直至膜面上染色液形成表面张力而终止加入。染色30 min后用自来水缓缓冲洗，凉干封片，在光学显微镜（BM2100型，南京江南永新光学有限公司）下观察。
关键词：金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）；血细胞；形态观察
中图分类号：Q969.93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4052-04
Morphological Observation on Larva Hemocytes of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.
XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng
（School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China）
Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.
Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.； hemocytes；morphous observation
昆虫是动物界中最大的类群，在长期进化的过程中形成了一套复杂的免疫系统，对入侵的病原体具有识别和清除能力，主要包括体液免疫和细胞免疫应答[1，2]。血细胞是昆虫细胞免疫的主要执行者，在抵抗病原体入侵的免疫应答过程中发挥着重要作用。昆虫种类不同，参与细胞免疫的血细胞种类不同[3]，血细胞的某些生理机能变化常常表现为细胞形态和组成的变化。因此，研究昆虫血细胞形态分类对深入揭示其细胞免疫功能具有重要推动作用。自1669年Swammerdam首次发现昆虫的“白”血细胞以来[4，5]，人们对昆虫血细胞的研究已有 340多年的历史，涉及蚊（Culicidae）、蝇（Muscidae）、 蚋（Simuliidae）、蜚蠊（Blattaria）、蚕（Bombyx mori）、粘虫[Mythimna separata（Walker）]等100多种昆虫[6，7]。由于昆虫种类繁多，其血细胞形态各异，甚至同一种昆虫不同虫态、虫龄在不同生态、生理条件下的血细胞形态也存在显著差异。昆虫血细胞的分类比较复杂，存在的分歧很多[8]。因此，应对更多种类的昆虫血细胞形态进行研究，以丰富其形态分类。
金银花尺蠖（Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.）是近年来新发现的为害金银花的食叶害虫之一，该虫为鳞翅目尺蛾科昆虫，别名拱腰虫，在安徽省1年发生3代[9]，常将叶片咬成缺刻或孔洞，危害严重的地块金银花叶片被全部吃光，仅剩叶脉和叶柄，常造成金银花大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失。目前，国内对金银花尺蠖的研究主要集中在生物学特性及防治方面[9-13]，对其血细胞的形态学研究尚未见报道。本研究对金银花尺蠖幼虫血细胞形态进行观察，以期为金银花尺蠖幼虫血细胞分类和细胞免疫研究提供试验依据， 同时也为金银花尺蠖的防治提供新途径。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
从滁州市郊三界镇野生金银花上采集金银花尺蠖幼虫，带回实验室于人工气候箱（RXZ-288A型，宁波江南仪器制造厂）中用新鲜的金银花叶片饲养多代，选取老熟幼虫备用。人工气候箱光周期（L∶D）为14 h∶10 h，温度为（25±1） ℃，相对湿度为（70±7）%。
1.2 试剂
Wright’s染料（Sigma公司）、Giemsa染料（德国AppliChem公司）、磷酸二氢钾（广东西陇化工股份有限公司）、磷酸氢二钠（广东西陇化工股份有限公司）、甘油（无锡市晶科化工有限公司）、甲醇（上海凌峰化学试剂有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 染液配制 Wright’s染液：称取Wright’s染料粉末0.1 g放在研钵内，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干净的棕色玻璃瓶中，在室温条件下密封保存，7 d后即可使用。
Giemsa染液：称取Giemsa粉0.75 g放入研钵中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中搅拌加热90 min，溶入50 mL甲醇中，摇匀后置于37 ℃恒温箱内保温8～12 h，过滤后置于棕色瓶中密封保存，即为Giemsa原液，12 h后即可使用。临用时，取1 mL Giemsa原液与10 mL PBS（pH 6.8）混合。
1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸缓冲液（PBS）
pH 6.8：称取磷酸氢二钠0.47 g，磷酸二氢钾0.46 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。
pH 7.2：称取磷酸氢二钠0.68 g，磷酸二氢钾0.25 g，加入少量去离子水溶解，再定容至1 000 mL。
1.3.3 涂片与观察 取金银花尺蠖老熟幼虫10头，用无菌水清洗后擦干，用解剖针将其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在载玻片上涂成血膜，先用Wright’s染液将血膜面充分覆盖，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再缓慢地一滴一滴加磷酸盐缓冲液（pH 7.2），直至膜面上染色液形成表面张力而终止加入。染色30 min后用自来水缓缓冲洗，凉干封片，在光学显微镜（BM2100型，南京江南永新光学有限公司）下观察。