樱桃菌根真菌分离培养条件及有效性
2022-06-09
摘要：采用PDA培养基、PDA-抗生素培养基以及MMN培养基，通过切片法从一年生樱桃（Prunus pseudocerasus）根中分离菌根真菌，用打孔法分离得到纯化菌株，并对菌株的生理生化特征进行系统鉴定。结果表明，切片分离时的表面消毒条件和方法以及分离培养基的选用均直接影响菌根真菌的分离纯化结果及菌根真菌的多样性。该菌利用HgCl处理6 min，接种在改良MMN培养基中分离效果最好，该菌的最适pH 7，最适温度为25 ℃，最适P浓度KH2PO4和K2HPO4分别为0.50 g/L和1.00 g/L，最适C源为可溶性淀粉，最适N源为尿素。毕业论文格式将该菌加入到生长基质中能将炼苗期的樱桃苗的成活率由73%提高到86%。
关键词：樱桃（Prunus pseudocerasus）；菌根真菌；分离；培养条件；有效性
中图分类号：O939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4025-04
Culture Conditions and Validity of Isolated Cherry
（Prunus pseudocerasus） Mycorrhizal Fungi
LIU Hui， WANG Zhi-li， XU Ying-ying， YANG Shou-jun
（Polytechnic Institute，China Agricultural University（Yantai）， Yantai 264670， Shandong， China）
Abstract： The process of isolating micorrhizal fungi from cherry root by sectioning was evaluated and the isolated fungi were identified. The isolated fungi were cultivated in the PDA medium， PDA-antibiotic medium and MMN medium and subsequently purified by punch method. The results showed that disinfection conditions and methods of slice surface and medium selection affected directly the purification and diversity of the fungi isolated. The best isolation was on the modified MMN medium as isolated fungi were sterilized by HgCl for 6 minutes. The isolated fungi could better growth at 25 ℃， pH 7.0， KH2PO4 0.50 g/L and K2HPO4 1.00 g/L. Soluble starch and urea were the best sources of carbon and nitride. Survival rate of cherry seedlings increased from 73 % to 86% after adding the isolated fungi into substrate.
Key words： cherry（Prunus pseudocerasus）； mycorrhizal fungi； isolation；culture conditions；validity
菌根（AM）是真菌菌丝与植物的根部紧密结合形成的一种特殊结构，与植物形成菌根的真菌称为菌根真菌[1-3]。在菌根共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大了根系的吸收面积，并可通过菌丝从土壤中吸收水分和矿质营养元素（尤其是P和N）传递给植物；另一方面，菌根真菌可以通过根内菌丝从宿主植物体内获得其生长繁殖所需的碳水化合物和一些生长物质，从而形成一种营养上的互利共生关系[4，5]。研究发现，樱桃（Prunus pseudocerasus）根系的侵染率为56.11%[6]，但目前国内对樱桃菌根共生体系建立方面的研究较少。本研究从一年生的樱桃根系中分离菌根真菌，并对该菌进行培养鉴定，最后将该菌与炼苗期的樱桃建立共生体系，为今后相关菌剂的生产和共生体系的建立奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植株 试验材料为一年生的樱桃幼苗和组培樱桃苗，分别由中国农业大学烟台校区试验基地及组培实验室提供。苗木均为长势良好、均匀一致的植株。
1.1.2 分离培养菌根真菌所用的培养基
1）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，无水CaCl2 0.02 g，ZnSO4 0.002 7 g，FeSO4 0.027 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。
2）PDA-抗生素培养基[7]：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，酒石酸铵少量，微量元素溶液3 mL（每1 000 mL微量元素混合液含有H3BO3 8.45 g，MnSO4 5.00 g，CuSO4·5H2O 0.63 g，FeSO4 6.00 g，ZnSO4 2.27 g，（NH4）2MoO4 0.27 g）。
3）MMN培养基[8]：CaCl2 0.05 g，NaCl 0.025 g， KH2PO4 0.5 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，FeCl3（1%溶液）1.2 mL，麦芽粉3 g，葡萄糖10 g，VB1 0.1 g，牛肉膏蛋白胨15 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 5.5。
1.2 方法
1.2.1 菌根真菌的分离和纯化培养 分离方法参照郭顺星等[9]的关于菌根真菌的分离方法，略作改进。取樱桃根根尖8～10 cm，清水洗净，用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。再用0.1%的HgCl溶液分别处理2、4、6、8 min，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。用灭菌解剖刀在培养皿中将根横切成1 cm长条，将长条分别置于PDA、PDA-抗生素、MMN培养基上，每个培养皿采用五点法放五根长条，每个处理梯度5次重复。在恒温25 ℃下培养7 d，观察比较不同处理时间和培养基感染情况及菌根真菌的出菌情况，并将未感染部分转至最佳培养基进行纯化培养。
1.2.2 最适温度的测定 采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入最优培养基中，每个梯度3次重复，将培养基分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的环境下培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。
1.2.3 最适pH的测定 将最优培养基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（pH为2、3的培养基将琼脂量提高1倍，使其凝固），采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同pH的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。
1.2.4 最适P浓度的测定 将最优培养基的KH2PO4和K2HPO4调节至（0.25，0.5）、（0.5，1）、（0.75，1.5）、（1，2）、（1.25，2.5） g/L，保持pH为最优值，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同P浓度的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。
关键词：樱桃（Prunus pseudocerasus）；菌根真菌；分离；培养条件；有效性
中图分类号：O939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4025-04
Culture Conditions and Validity of Isolated Cherry
（Prunus pseudocerasus） Mycorrhizal Fungi
LIU Hui， WANG Zhi-li， XU Ying-ying， YANG Shou-jun
（Polytechnic Institute，China Agricultural University（Yantai）， Yantai 264670， Shandong， China）
Abstract： The process of isolating micorrhizal fungi from cherry root by sectioning was evaluated and the isolated fungi were identified. The isolated fungi were cultivated in the PDA medium， PDA-antibiotic medium and MMN medium and subsequently purified by punch method. The results showed that disinfection conditions and methods of slice surface and medium selection affected directly the purification and diversity of the fungi isolated. The best isolation was on the modified MMN medium as isolated fungi were sterilized by HgCl for 6 minutes. The isolated fungi could better growth at 25 ℃， pH 7.0， KH2PO4 0.50 g/L and K2HPO4 1.00 g/L. Soluble starch and urea were the best sources of carbon and nitride. Survival rate of cherry seedlings increased from 73 % to 86% after adding the isolated fungi into substrate.
Key words： cherry（Prunus pseudocerasus）； mycorrhizal fungi； isolation；culture conditions；validity
菌根（AM）是真菌菌丝与植物的根部紧密结合形成的一种特殊结构，与植物形成菌根的真菌称为菌根真菌[1-3]。在菌根共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大了根系的吸收面积，并可通过菌丝从土壤中吸收水分和矿质营养元素（尤其是P和N）传递给植物；另一方面，菌根真菌可以通过根内菌丝从宿主植物体内获得其生长繁殖所需的碳水化合物和一些生长物质，从而形成一种营养上的互利共生关系[4，5]。研究发现，樱桃（Prunus pseudocerasus）根系的侵染率为56.11%[6]，但目前国内对樱桃菌根共生体系建立方面的研究较少。本研究从一年生的樱桃根系中分离菌根真菌，并对该菌进行培养鉴定，最后将该菌与炼苗期的樱桃建立共生体系，为今后相关菌剂的生产和共生体系的建立奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植株 试验材料为一年生的樱桃幼苗和组培樱桃苗，分别由中国农业大学烟台校区试验基地及组培实验室提供。苗木均为长势良好、均匀一致的植株。
1.1.2 分离培养菌根真菌所用的培养基
1）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，无水CaCl2 0.02 g，ZnSO4 0.002 7 g，FeSO4 0.027 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。
2）PDA-抗生素培养基[7]：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，酒石酸铵少量，微量元素溶液3 mL（每1 000 mL微量元素混合液含有H3BO3 8.45 g，MnSO4 5.00 g，CuSO4·5H2O 0.63 g，FeSO4 6.00 g，ZnSO4 2.27 g，（NH4）2MoO4 0.27 g）。
3）MMN培养基[8]：CaCl2 0.05 g，NaCl 0.025 g， KH2PO4 0.5 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，FeCl3（1%溶液）1.2 mL，麦芽粉3 g，葡萄糖10 g，VB1 0.1 g，牛肉膏蛋白胨15 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH 5.5。
1.2 方法
1.2.1 菌根真菌的分离和纯化培养 分离方法参照郭顺星等[9]的关于菌根真菌的分离方法，略作改进。取樱桃根根尖8～10 cm，清水洗净，用75%酒精处理30 s，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。再用0.1%的HgCl溶液分别处理2、4、6、8 min，无菌水冲洗3次，滤纸吸干。用灭菌解剖刀在培养皿中将根横切成1 cm长条，将长条分别置于PDA、PDA-抗生素、MMN培养基上，每个培养皿采用五点法放五根长条，每个处理梯度5次重复。在恒温25 ℃下培养7 d，观察比较不同处理时间和培养基感染情况及菌根真菌的出菌情况，并将未感染部分转至最佳培养基进行纯化培养。
1.2.2 最适温度的测定 采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入最优培养基中，每个梯度3次重复，将培养基分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的环境下培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。
1.2.3 最适pH的测定 将最优培养基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11（pH为2、3的培养基将琼脂量提高1倍，使其凝固），采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同pH的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。
1.2.4 最适P浓度的测定 将最优培养基的KH2PO4和K2HPO4调节至（0.25，0.5）、（0.5，1）、（0.75，1.5）、（1，2）、（1.25，2.5） g/L，保持pH为最优值，采用打孔法，在距离菌心相同半径打1 cm的菌饼，放入不同P浓度的培养基中，每个梯度3次重复，在恒温25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径。