Colo205来源大肠癌始动细胞分转移相关基因的表达分析
2022-06-09
【摘要】目的 获得大肠癌始动细胞转移相关基因表达变化谱，其细胞生物学特性研究提供依据。方法 采用无血清悬浮培养、CD133抗体标记磁珠分选Colo205不同细胞群，体外分化实验及裸鼠成瘤实验鉴定细胞特性，表达谱测序分析转移相关基因表达变化。结果：3种细胞群中有14种癌症转移相关基因发生显著地表达改变。 结论：无血清培养基培养结合CD133磁珠分选Colo205细胞获得的CD133+细胞亚群具备大肠癌干细胞的基本特征且有14种转移相关基因表达发生显著改变，可用于后续生物学特性研究。
【关键词】始动细胞;大肠癌;表达谱测序;转移基因
Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.
Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0001-02
大肠癌（colorectal cancer）是目前国内发病率次仅于肺癌、乳腺癌的严重危害人类健康的恶性肿瘤，近年来结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1，2]。一般认为大肠癌发病机制与环境、遗传、大肠腺瘤以及慢性大肠炎症有关的涉及多个癌基因激活和抑癌基因失活渐变过程[3，4]。 肿瘤干细胞理论认为癌症难以治愈的一个重要原因是肿瘤中具有干细胞（Stem Cell）性质的癌细胞即肿瘤始动细胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大肠癌干细胞是消化道恶性肿瘤中第一个被发现的癌症始动细胞，分选并鉴定不同来源的肠癌始动细胞对于其后续的生物学特性分析、大肠癌诊断及综合防治措施的制定等具有极为重要的意义[6]。本研究通过CD133+
标记的免疫磁珠分选大肠癌始动细胞，利用体外分化实验和裸鼠成瘤实验对分选的大肠癌始动细胞的干细胞特性进行鉴定和验证，并用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变。可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞株与动物 人大肠癌colo205细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库; 4周龄BABL/ c雄裸鼠购自第三军医大学大坪医院动物中心，9只，体重20-25g，饲养于遵义医学院医学与生物研究中心SPF动物饲养房。
1.1.2 主要试剂TRIzol?、 B27添加剂（B27）及实验所需生长因子购自Invitrogen公司;二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶粉购自Sigma公司;培养基及血清购自Gibco公司; CD 133细胞分选试剂盒 （CDl33 Cell Isolation Kit） 购自Miltenyi公司。常规细胞培养等无酶耗材均购自杭州爱思进公司。无血清培养基（serum free medium，SFM）为本实验新鲜配制（98ml DMEM/F12培养基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超纯水定容到100ml，过滤灭菌，- 20℃保存，备用）。表达谱测序全套试剂购自Illumina公司。
1.2 方法
1.2.1 Colo205始动细胞分选 取对数增长期Colo205细胞，以105/ mL的细胞密度接种至SFM中培养;每2～ 3d加入2ml SFM培养基换液;10d后用酶消化法及机械分离法将colo205干细胞球分离成单细胞悬液后传代。将形态稳定的colo205干细胞单细胞悬液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分选 Buffer洗涤细胞，800rpm、离心10min，弃上清。分选Buffer重悬细胞，将细胞悬液过柱，收集CD133-细胞，用500μl分选 和CD133+阳性细胞。
【关键词】始动细胞;大肠癌;表达谱测序;转移基因
Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.
Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0001-02
大肠癌（colorectal cancer）是目前国内发病率次仅于肺癌、乳腺癌的严重危害人类健康的恶性肿瘤，近年来结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1，2]。一般认为大肠癌发病机制与环境、遗传、大肠腺瘤以及慢性大肠炎症有关的涉及多个癌基因激活和抑癌基因失活渐变过程[3，4]。 肿瘤干细胞理论认为癌症难以治愈的一个重要原因是肿瘤中具有干细胞（Stem Cell）性质的癌细胞即肿瘤始动细胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大肠癌干细胞是消化道恶性肿瘤中第一个被发现的癌症始动细胞，分选并鉴定不同来源的肠癌始动细胞对于其后续的生物学特性分析、大肠癌诊断及综合防治措施的制定等具有极为重要的意义[6]。本研究通过CD133+
标记的免疫磁珠分选大肠癌始动细胞，利用体外分化实验和裸鼠成瘤实验对分选的大肠癌始动细胞的干细胞特性进行鉴定和验证，并用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变。可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞株与动物 人大肠癌colo205细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库; 4周龄BABL/ c雄裸鼠购自第三军医大学大坪医院动物中心，9只，体重20-25g，饲养于遵义医学院医学与生物研究中心SPF动物饲养房。
1.1.2 主要试剂TRIzol?、 B27添加剂（B27）及实验所需生长因子购自Invitrogen公司;二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶粉购自Sigma公司;培养基及血清购自Gibco公司; CD 133细胞分选试剂盒 （CDl33 Cell Isolation Kit） 购自Miltenyi公司。常规细胞培养等无酶耗材均购自杭州爱思进公司。无血清培养基（serum free medium，SFM）为本实验新鲜配制（98ml DMEM/F12培养基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超纯水定容到100ml，过滤灭菌，- 20℃保存，备用）。表达谱测序全套试剂购自Illumina公司。
1.2 方法
1.2.1 Colo205始动细胞分选 取对数增长期Colo205细胞，以105/ mL的细胞密度接种至SFM中培养;每2～ 3d加入2ml SFM培养基换液;10d后用酶消化法及机械分离法将colo205干细胞球分离成单细胞悬液后传代。将形态稳定的colo205干细胞单细胞悬液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分选 Buffer洗涤细胞，800rpm、离心10min，弃上清。分选Buffer重悬细胞，将细胞悬液过柱，收集CD133-细胞，用500μl分选 和CD133+阳性细胞。