微卫星在道地药材群体遗传学研究中的应用与展望

　　[摘要]作者介绍了微卫星和群体遗传学的基本概念和其特点，阐述了微卫星在群体遗传学中对于居群的遗传结构和遗传多样性研究、基因流分析和进化显著单元ESU的划分研究应用，探讨了微卫星引入群体遗传学在道地药材遗传成因、栽培起源和产地鉴别等方面的应用前景，旨在为道地药材的研究提供了新的理论和方法。

　　[关键词]微卫星；群体遗传学；道地药材；遗传成因；栽培起源；产地鉴别

　　[收稿日期]2013-07-01

　　[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81274027）；国家自然科学基金重点项目（81130070）；中国中医科学院中药研究所基本科研业务费自主选题项目（2011ZDXK-01）；北京市共建项目专项

　　[通信作者]中药的道地性是自古延用至今评价中药材质量的一项独特标准，道地药材就是指在特定自然条件、生态环境的地域内所产的药材，且生产较为集中，栽培技术、采收加工也都有一定的讲究，以致较同种药材在其他地区所产者品质佳、疗效好、为世所公认而久负盛名者称之[1]。黄璐琦等指出道地药材的生物学本质是同种异地，即同一物种因其具有一定的空间结构，能在不同的地点上形成大大小小的群体单元，如果其中某一群体单元产生质优效佳的药材，即为道地药材[2]。这个同一物种在不同地点上形成的群体单元，在生物学上称为居群。因此，道地药材在生物学上就是指某一物种的特定居群，是在特定时间和空间里生长的自然或人为的同种个体群，居群水平的遗传分化是道地药材形成的遗传基础，遗传分化越明显，道地药材与同种其他居群药材的差异越明显[3]，由此他对道地药材的形成机制提出了“道地性越明显，其基因特化越明显”的模式假说[4]。

　　目前关于道地药材遗传基础的研究多停留在遗传多样性的基本分析和描述，难以揭示道地药材遗传分化和遗传成因的深层次问题，如①道地药材居群是如何进化形成的，与非道地药材居群的遗传分化程度有多大？这种遗传分化与道地性的形成是否相关？②道地栽培居群是否起源于道地野生居群，它们的种质是否存在差异？这种差异是否产生种质混杂而引起远交衰退最终影响药材的道地性？③道地药材是否可能实现产地的分子鉴别（种内鉴别）？如何筛选道地药材的分子地理标识？这些问题的解决必须深入了解道地居群形成的进化历史，掌握影响道地居群遗传分化的现代因素（如基因流、自然选择或人工选择等）和历史性事件（如片断化、快速扩展和拓殖现象等），这些属于群体遗传学范畴，需要将群体遗传学的理论和方法引入道地药材的研究。

　　群体遗传学（populationgenetics）又称种群遗传学，是根据遗传学原理，采用数学、统计或其他方法研究生物居群的遗传结构及其演化规律的一门学科，即研究种内进化（微进化microevolution）的科学。种内进化促成了等位基因在居群水平的空间分布和不断改变，从而引起居群间的遗传分化。20世纪90年代以来，随着PCR技术的广泛应用，RAPD，RFLP，AFLP等指纹技术[5]为群体遗传学的研究提供了有效手段，而微卫星与这些指纹技术相比又具有突出的优势。由于微卫星具有高度多态性、在基因组中含量丰富且分布均匀等优点，这一技术很快便发展为一种分子标记，成为群体遗传学研究的有力工具，本文旨在介绍微卫星群体遗传学基本理论和研究方法的基础上，将其引入道地药材的研究，为赋予道地药材现代科学内涵提供新的研究手段。

　　1微卫星的概念、分布及优点

　　1.1微卫星的概念及在真核生物基因组中的分布

　　微卫星（microsatellites），又称简单序列重复（simplesequencerepeats，SSR），是指以少数几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的简单的串联重复序列，由于重复的次数不同以及重复的程度不一致而造成这些序列的多态性[6]。微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传。

　　微卫星序列普遍存在于大多数真核生物的核基因组中。据估计，人类基因组中每6kb就存在一个微卫星位点[7]。在不同分类群的物种之间以及同一分类群的不同物种之间微卫星的平均密度差异很大，例如，植物基因组中的微卫星约比动物基因组中的少5倍[8]，而鸟类约比人类少6～7倍[9]，目前尚无法解释这种现象[10]。微卫星的重复单位以1～2个核苷酸为主，也有一些微卫星的重复单位为3个核苷酸，极少数为4个或4个以上核苷酸[8]。在以双核苷酸为重复单位的微卫星中，人和动物（CA）n含量最高[7]，植物中（尤其是作物中）以（GA）n和（AC）n为主[11]。

　　1.2微卫星作为遗传标记的优点

　　用微卫星作为遗传标记与其他DNA分子标记（如RAPD，RFLP，AFLP，小卫星DNA等）相比具有以下优点：①作为一种高度多态性的分子标记，微卫星DNA具有丰度高、共显性标记、选择中性的特点；②微卫星采用单位点DNA指纹技术，检测容易，重复性较好；③微卫星DNA扩大了取样范围，减轻了取样工作的困难和对研究对象的影响；④微卫星DNA的出现为群体遗传学家提供了空前丰富的遗传信息资料，同时也促进了相应的统计分析方法的发展[12]，包括最大似然性法（maximumlikelihood）、凝聚法（coalescentmethods）和bayesian法（bayesianmethods）。

　　2微卫星在群体遗传学研究中的应用

　　2.1居群遗传多样性和遗传结构分析

　　居群的遗传多样性是长期进化的产物，也是种质资源创新和品种改良的物质基础。一个居群遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。物种的遗传多样性往往与物种本身的特性相关，如生活史的长短、交配系统和繁殖方式、地理分布及遗传变异水平高低等[13-15]。遗传结构是指基因或基因型在空间和时间上的非随机分布，居群的遗传结构包括居群内的遗传变异和居群间的遗传分化。对遗传结构及其影响因子的研究是探讨生物适应意义、物种形成过程及其进化机制的基础，也是保护生物学的核心之一。一个物种的遗传结构是长期进化的产物，许多物种独特的遗传结构反映了进化历史上的一些特殊事件[16-17]。生物多样性保护的关键之一是保护物种，更具体地说就是保护物种的遗传多样性或进化潜力，制定有效的保护策略和措施必须建立在对遗传结构充分了解的基础上。微卫星是进行居群遗传多样性和遗传结构研究的有效分子标记，目前已对草本植物[18-19]、花卉[20]、树木[21-24]等进行了研究，而对药用植物，特别是道地药材遗传多样性和遗传结构的深入研究还很缺乏。

　　2.2基因流分析

　　基因流是指生物个体从其发生地分散出去而导致不同居群之间基因交流的过程。植物的基因流主要靠花粉和种子的传播来完成[25-29]，基因流的大小直接影响着居群间遗传物质是否均质化以及遗传分化的程度，因此基因流是决定居群遗传结构的重要因素[30]，通过基因流可以了解居群过去的进化历史、掌握居群现在的遗传结构并预测居群将来的演化趋势，由此作出保护和可持续利用的有效策略。基因流的传统测定方法是通过收集器或染色跟踪花粉和种子的运动，但这些方法常常低估居群的基因流，而且也无法计算有效基因流的大小[31]。基因流可以通过亲本分析来测定[32]，采用亲本分析方法确定种子或幼苗的双亲之后，可以根据双亲之间的距离精确地测定花粉的传播距离，幼苗与母本间的距离（雌雄异株）或种子与双亲之间的平均距离（雌雄同株）即为种子散布距离。当花粉或种子从一个居群扩散到另一个居群，就形成居群间基因流，这种基因流是阻止居群遗传分化的重要进化因子。在后代的亲本分析中，有些后代的亲本不能由居群内的个体形成，根据这些后代的比率可以估算出居群间基因流与居群内基因流的相对强度。微卫星高度的多态性、共显性等特点，在亲本分析中具有突出的优势，目前利用微卫星对基因流进行的研究有很多[33-34]，但对药用植物基因流的研究基本没有，特别是药用植物在栽培过程中人为引起基因流改变而影响其进化潜能的研究还属空白，这直接关系到中药资源是否能可持续利用。