酮康唑经糖尿病及正常大鼠皮肤的体外透过性差异比较

　　糖尿病（diabetesmellitus，DM）是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，可引起患者多系统损害，是由遗传原因和环境因素作用而累及全身，需要长期治疗、困扰全球的慢性代谢性疾病。糖尿病易引起皮肤损害，临床表现多种多样，局部外用酮康唑药物后，受损皮肤很可能影响药物的吸收，故糖尿病人对这些药物的渗透及经皮吸收与正常人相比理论上应该是有差异的。本文采用正常及糖尿病大鼠的皮肤对酮康唑外用制剂进行体外扩散实验，比较药物的透过性是否发生了改变，报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1仪器与试剂

　　日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20AT检测器；TK-20A型药物透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）。酮康唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号100294-200602），酮康唑原料药（纯度≥99%，广州越迪化工有限公司分装），高效液相试剂甲醇为色谱纯，凝胶剂、乳膏剂、软膏剂基质辅料等其他试剂均为分析纯[1]。

　　1.2实验动物

　　正常SPF级雄性Wistar大鼠，体重（230±10）g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK（粤）2006-0015。实验动物室温度（22±2）℃，相对湿度（50±5）%，光照/黑暗12h交替，环境安静，给予普通饲料和清洁饮水。糖尿病大鼠常规饲料喂养2周，第2周末对其禁食12h，于次日清晨测空腹血糖的浓度，剔除血糖过高（>6mmol/L）或偏离正常值较大的动物，称重，给予大鼠腹腔注射0.1mol/L（pH4.4）枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解的1%链脲菌素造模，注射剂量40mg/kg，正常对照组大鼠单次腹腔注射等容量的0.1mol/L（pH4.4）枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。注射1周后，用血糖仪测尾尖血糖，以血糖>16.7mmol/L作为糖尿病成型标准[2]。

　　1.3实验方法

　　1.3.1大鼠分组

　　取36只正常对照组大鼠，随机分为6组，每组6只，分别为酮康唑凝胶-正常对照组、酮康唑乳膏-正常对照组和酮康唑软膏-正常对照组；酮康唑凝胶-糖尿病模型组、酮康唑乳膏-糖尿病模型组和酮康唑软膏-糖尿病模型组。

　　1.3.2酮康唑凝胶、乳膏、软膏及其供试品的制备

　　1.3.2.1酮康唑凝胶制备酮康唑2g，羟丙基甲基纤维素（HPMC）2g，无水乙醇45ml，甘油10g，氮酮1g，亚硫酸钠0.1g，水39.9g，制成100g。将酮康唑溶解在乙醇-水溶液，水浴（不超过70℃）加热溶解，放冷后，再加入处方量的甘油、氮酮、抗氧剂，加水适量，再缓缓加入羟丙基甲基纤维素醚（HPMC），边加边搅拌，加水至100g，最后放置过夜，使其充分溶胀，混合均匀、细腻，得到凝胶剂。

　　1.3.2.2酮康唑乳膏制备酮康唑原料药2g，硬脂酸10g，单硬脂酸甘油酯5g，液体石蜡14ml，白凡士林5g，甘油5g，十二烷基硫酸钠（SDS）0.1g，三乙醇胺0.35g，蒸馏水61.6mL，制成100g。将酮康唑原料药用适量甘油研成糊状，备用。将油相（硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、白凡士林）置水浴中加热熔化，调节温度在80℃，保温；将水相（SDS、甘油、三乙醇胺，蒸馏水）加热至80℃，使温度保持在80℃（略高于油相）。将水相缓慢加入油相中，按同一方向边搅拌，直至60℃左右，再将其加到酮康唑与甘油混合物中，继续搅拌，至冷凝即可。

　　1.3.2.3酮康唑软膏制备[3]酮康唑原料药2g，丙二醇5g，聚乙二醇400030g，聚乙二醇40060.5g，无水亚硫酸钠0.2g，蒸馏水2g，制成100g。将酮康唑与丙二醇调和成均匀的糊状，然后将聚乙二醇4000加入聚乙二醇400中，加热至85℃使其全部溶解后，放入40℃以下水浴中搅拌，加入预先用丙二醇调好的酮康唑，和用蒸馏水溶解好的无水亚硫酸钠，搅拌均匀即可。

　　1.3.3PBS（pH7.4）缓冲液的制备

　　1.3.3.1PBS储存液（0.1mol/L）配方NaCl8g，Na2HPO4·12H2O2.89g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，加蒸馏水至100ml。贮存液室温下可保存1个月。

　　1.3.3.2Franz实验接收液配制（10%乙醇PBS）取贮存液10倍稀释后，配制成含乙醇10%的PBS接收液，24h内使用。

　　1.3.4体外透皮扩散实验

　　在大鼠糖尿病造模4周后，分别取糖尿病组和正常组的大鼠腹部皮肤进行透皮实验。具体步骤为：将大鼠用10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉（剂量30mg/kg），固定在鼠板上，用电剃刀除去腹部鼠毛，取下已去毛的鼠皮，放血处死动物，并除去皮下脂肪待用。取处理好的大鼠腹部皮肤固定在扩散池中（一张鼠皮可做3～5份样品）。透皮扩散有效内径为1.8cm，接受室体积为6.5ml，接收液为10%乙醇PBS（pH7.4）。整个实验过程恒温（37±0.2）℃，300r/min搅拌。分别称取酮康唑凝胶、乳膏或软膏2g加于供应室中，供应室上用保鲜膜封口，防止水分蒸发。分别于0.5、1、2、4、6、8、12和24h从接受液中取样0.5ml，同时补充相同体积相同温度的新鲜接受液。样品离心10min（15000r/min），取上清液用HPLC法测定药物的含量。酮康唑皮肤透过液HPLC检测方法参照文献[4]。

　　1.4数据处理方法

　　采用Prism5.0软件进行作图。将HPLC测得的浓度数据用Excel软件计算得到累计透过量Q及渗透速率PR，所得结果用均数±标准差（x±s）表示。

　　采用SPSS13.0软件进行统计处理。正常组与造模组大鼠渗透速率比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。