四种当归多糖提取方法的比较研究

　　中图分类号：R284.2文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.009

　　当归为伞形科植物当归[Angelicasinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，是一种常用的传统中药，有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效[1]。近年来对当归的药理研究表明，从其水溶性部分提取的当归多糖具有丰富的生物活性，具有明显的补血活血、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射损伤等药理活性[2]。因此，当归多糖是当归药效成分研究的热点。对于当归多糖的提取方法，文献报道的多为热水浸提法[3-5]，还有超声提取法[6]、酶提取法[7]、微波提取法[8]。现有文献均为对某一种提取当归多糖的方法进行研究，未见对几种方法同时进行比较研究的文献报道。笔者采用同一种当归原料，以当归多糖得率为考察指标，对热水浸提法、超声波法、纤维素酶法和果胶酶法这4种当归多糖提取法进行研究并进行比较，得出较佳的当归多糖提取法，这对当归多糖的开发应用具有一定意义。

　　1材料和方法

　　1.1材料和仪器

　　原料：当归头（广东紫云轩药业有限公司），购自肇庆市大森林药店，产自甘肃。

　　试剂：纤维素酶（2000IU·g-1）、果胶酶（20000IU·g-1），北京鸿润宝顺科技有限公司。苯酚、葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸、醋酸、醋酸钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠均为分析纯。试验用水为去离子水。

　　仪器：S22PC可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；SK8200H台式超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；DHG-9070B型数显电热恒温干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。HH-S2系列恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）；电子分析天枰AUY120（ShimadzuCorporationJanpan）；pHS-29A型酸度计（上海大普仪器有限公司）。

　　1.2当归原料的处理

　　将当归用粉碎机粉碎，在65～70℃烘干，密封备用。

　　1.3当归多糖提取的方法

　　1.3.1热水浸提法准确称取2g当归，置于烧杯中，加入蒸馏水，放入恒温水浴锅浸提，冷却，转移至250mL容量瓶，定容，过滤，滤液备用。

　　1.3.2超声波法准确称取2g当归，置于烧杯中，加入蒸馏水，放入超声仪中超声提取，冷却，转移至250mL容量瓶，定容，过滤，滤液备用。

　　1.3.3酶法提取准确称取2g当归，置于烧杯中，加入HAc-NaAc缓冲溶液，加酶保温一定时间，加热灭酶，冷却，转移至250mL容量瓶，定容，过滤，滤液备用。

　　1.4当归多糖的测定与计算

　　1.4.1测定波长的选择准确称取干燥至恒质量的葡萄糖0.1g，配制成0.1mg·mL-1的葡萄糖水溶液，吸取0.6mL置于10mL刻度试管中，加水1.4mL，然后加5%的苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀，放置10min，置沸水浴中加热15min，取出用流水冷却至室温。以蒸馏水2.0mL，按上述方法加入5%苯酚和硫酸作试剂空白，从480～495nm进行吸光度测定，结果得出在487nm处吸光度最大，因此选择测定波长为487nm。

　　1.4.2标准曲线的绘制准确吸取0.1mg·mL-1标准葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL，分别置于试管中，各加入蒸馏水使总体积为2.0mL，按1.4.1中的步骤操作，于487nm波长处测吸光度A，并得出工作曲线。

　　1.4.3当归中还原糖与蔗糖等低聚糖总量的测定准确称取2g当归，置于250mL容量瓶中，加入100mL水，在45℃水浴中提取30min，冷却，加入5mL醋酸锌与5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，干滤纸过滤，弃去初滤液。取滤液50mL至100mL容量瓶，加入6mol·L-1的HCl5mL，在68～70℃水浴加热15min，冷却，加2滴甲基红，加入20%NaOH中和，定容，备用[9]。根据GB/T5009.9-2003食品中还原糖测定法中的直接滴定法测定还原糖含量[10]。

　　1.4.4多糖得率的测定与计算准确吸取1.0mL当归提取液，以水定容至50mL，准确吸取1mL，加入蒸馏水使总体积为2.0mL，按1.4.1从"加5%苯酚试液1mL"起操作，在487nm波长处测定吸光度A，根据标准曲线求出样液中当归总糖的含量，按下列计算式计算总糖与多糖得率：

　　总糖含量=×100%

　　式中：ρ为测定样液总糖浓度（mg·mL-1），n为测定样液的稀释倍数，V为样液总体积，m为样品质量（g）。

　　热水浸提法、超声法：多糖得率=总糖含量（%）-还原糖与蔗糖等低聚糖总量（%）

　　酶法：多糖得率=总糖含量（%）-还原糖与蔗糖等低聚糖总量（%）-酶空白（%）

　　2结果与分析

　　2.1超声波法

　　2.1.1料液比对多糖得率的影响所用超声仪不可调节温度与功率，功率固定为500W。准确称取5份当归，选择料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，试验料液比对多糖得率的影响，试验结果见图1。由图1可知，随着料液比增大，多糖得率增加，多糖得率在料液比为1∶40时达到最大；料液比再增大，多糖得率反而降低，因此选定料液比为1∶40。

　　2.1.2超声时间对多糖得率的影响准确称取5份当归，选定料液比为1∶40，分别超声20，30，40，50，60min，试验超声时间对多糖得率的影响，试验结果见图2。由图2可知，多糖得率在超声时间为30min时达到最大；时间继续增大，多糖得率逐渐降低。因此选定超声时间为30min，此时的多糖得率为22.15%。

　　2.2热水浸提法

　　选择热水浸提法的试验因素为料液比、温度、时间，每个因素设3个水平进行正交试验，正交试验设计与结果见表1。

　　从表1可知，极差R大小为RC>RB>RA，即时间对多糖得率影响最大，温度的影响次之，料液比的影响最小。最佳提取条件为A2B2C2，即料液比1∶40，提取温度80℃，提取时间3h。按最佳提取条件进行验证试验，多糖得率为21.78%。