急性呼吸窘迫综合征患者血清Cc16蛋白和miRNA-122表达及其临床意
2022-06-08
摘要：目的:探讨急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血清Cc16蛋白、miRNA-122的表达水平及其与预后的关系。方法:回顾性分析68例ARDS患者的临床资料，其中死亡组53例，存活组15例，另选取同期健康体检者45例为对照组。采用Kaplan-Meier法分析患者的生存期，应用Logistic分析影响患者预后的因素。结果:ARDS存活组与死亡组平均肺动脉压、平均气道压、肺损伤评分、C反应蛋白、降钙素原、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、Cc16蛋白和miRNA-122表达水平显着高于对照组，且死亡组C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16蛋白及miRNA高于存活组(均P <0. 05)。Kaplan-Meier分析显示Cc16蛋白低表达组总体生存率显着高于高表达组(51. 85%vs 18. 15%,P <0. 01),miRNA-122低表达组生存率显着高于高表达组(60. 92%vs20. 13%,P <0. 05); Logistic单因素分析显示ARDS预后与C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16、miRNA-122相关; Logistic多因素分析显示ALT、Cc16、miRNA-122是影响ARDS预后的独立危险因素。结论:ARDS患者血清Cc16蛋白和miRNA-122表达量异常增高与预后不良密切相关。
关键词：急性呼吸窘迫综合征; 血清Cc16蛋白; miRNA-122; 预后;
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由非心原性因素引起的急性弥漫性肺部炎症，患者多表现为呼吸窘迫、低氧血症、低顺应性。有报道称，Cc16蛋白可作为ARDS的早期标志物[1]。miRNAs是内源基因编码的非编码单链RNA，可通过诱导或沉默基因的表达进而参与疾病的发生发展过程[2]。miRNA-122是一种肝脏特有RNA，其参与肝脏的多种生理、病理发展过程，可作为急性肝损伤的早期标志物。研究报道，miRNA-122可以预测ARDS患者的死亡率[3]。本研究探讨ARDS患者Cc16蛋白、miRNA-122表达水平与预后的关系，报道如下。
方法收集受试者性别、年龄、体重指数(body mass index,BMI)、平均肺动脉压、平均气道压、肺损伤评分等临床资料，其中肺损伤采用Murray等[5]提出的肺损伤评分(lung injury score,LIS)体系，0分为无肺损伤，分值越高，肺损伤越严重。患者入ICU后24 h内采集血液5 m L，于室温避光静置15 min,3 000 r/min离心15 min，分离血清于无菌EP管中，置于-20℃冰箱中保存待测，避免反复冻融。采用全自动生化分析仪(日式7020)测定天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素浓度，试剂盒购自南京建成生物工程研究所;采用酶联免疫吸附法检测血清Cc16蛋白、C反应蛋白、降钙素原水平，试剂盒购自上海沪宇生物科技有限公司，检测步骤按照试剂盒说明书进行。
按照miRNA试剂盒说明书提取血清总RNA，核酸蛋白检测仪测定miRNA的光密度(optical density,OD)，计算miRNA的纯度和浓度。使用miR-NA反转录试剂盒(TAKARA公司)将miRNA反转录为cDNA;逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法检测血清中miRNA-122的相对表达量。RT-qPCR反应体系为20 L:2×miRcute miRNA Premix 10 L，上下游引物各0.5 L,c DNA模板2 L,dd H2O补足20 L;反应设置为94℃预变性2 min,94℃20 s,60℃20 s,72℃延伸20 s，共40个循环。以U6为内参基因。引物由上海生工合成，引物序列，基因:U6，正向引物5'-3':ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，反向引物5'-3':GGAACGCTTCACGAATTTG;基因:miR-NA，正向引物5'-3':CAAGCGTTGGAGTGTGACA，反向引物5'-3':CGTCCTACCATTCTCCAGC。反应结束后采用2-ΔΔCt法计算miRNA-122的相对表达量。随访30d，统计生存率。
统计学处理采用SPSS 20.0统计软件包，计量资料以
表示，2组间比较采用t检验，3组比较采用方差分析;计数资料以百分数(%)表示，采用χ2检验;采用Kaplan-Meier法对患者的生存期进行分析，Logistic分析影响患者预后的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。
表1 各组一般资料比较
miRNA-122水平RT-qPCR检测显示ARDS死亡组与存活组患者miRNA-122表达水平显着高于对照组(P<0.05)，且死亡组高于存活组(P<0.05)，见图1、表2。
图1 miRNA-122表达水平
注:*P<0.05,**P<0.01
表2 各组miRNA-122表达水平
Cc16蛋白、miRNA-122与ARDS患者预后的关系Kaplan-Meier分析结果显示Cc16蛋白低表达组生存率显着高于高表达组(51.85%vs 18.15%,P<0.01),miRNA-122低表达组生存率显着高于高表达组(60.92%vs 20.13%,P<0.05)。
影响ARDS预后的单因素Logistic分析以预后为因变量，以可能影响预后的因素为自变量进行Logistic单因素分析，结果显示ARDS预后与C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16、miRNA-122相关(均P<0.05)，见表3。
表3 ARDS预后的单因素Logistic比较
影响ARDS预后的多因素Logistic分析将单因素分析中与ARDS预后相关的指标纳入Logistic回归模型，分析结果显示ALT、Cc16、miRNA-122是影响ARDS预后的独立危险因素，见表4。
表4 ARDS预后的多因素Logistic分析
Cc16细胞通过分泌特异性蛋白Cc16，参与细支气管修复和毒素清除，Cc16蛋白可作为肺-血屏障、肺泡原毛细血管通透性完整的敏感标志物[7,8]。初期ARDS患者因抗氧化应激增强，Cc16细胞分泌Cc16蛋白增多，血清Cc16水平升高[9]。随着病情加重，Cc16细胞受损，分泌能力减弱，Cc16蛋白水平下降。但ARDS恶化造成屏障完整性受损，通透性增强，血清Cc16蛋白水平仍然增加[10]。本研究中ARDS死亡组与存活组患者Cc16蛋白水平显着高于对照组，且死亡组高于存活组，表明随着病情恶化，Cc16蛋白显着升高。Kaplan-Meier分析显示Cc16蛋白低表达组生存率显着高于高表达组，且Cc16蛋白是影响患者预后的危险因素。
miRNA广泛表达于多种动植物中，其通过抑制靶基因转录、促进其降解。研究报道miRNA-122是急性肝损伤的早期标志物[11]。miRNA-122在ARDS引起的微血管损伤、微血管血流、细胞氧合中也具有重要作用[12]。Wang等[13]研究表明miRNA-122可作为ARDS的标志物且与患者28 d生存率相关。本研究中ARDS组miRNA-122蛋白水平显着高于对照组，死亡组显着高于存活组，表明miRNA-122参与疾病的进展。Kaplan-Meier分析结果显示miRNA-122表达与ARDS患者生存率显着相关，miRNA-122低表达组生存率显着高于高表达组。Logistic单因素、多因素分析显示miRNA-122是影响患者预后的危险因素。
参考文献
[1]林锦乐，傅萱，曾世永，等．急性呼吸窘迫综合征患者血清Clara细胞蛋白16表达及与肺顺应性关系[J]．中华实用诊断与治疗杂志，2018,32(3):265-268.
[2] 周巧．微RNAs调控p38MAPK信号通路与疾病关系的研究进展[J]．重庆医学，2018,47(16):104-106.
[3] 郝金香，许俊旭，梁勇，等．miR-122联合APACHEⅡ评分对ARDS患者预后的评估价值[J]．中华危重病急救医学，2019,31(6):694-698.
[4] 中华医学会重症医学分会．急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南(2006)[J]．中国实用外科杂志，2007,28(1):19-28.
[5] Murray JF,Matthay MA,Luce JM,et al. An expanded definition of the adult respiratory distress syndrome[J]. Am Rev Respir Dis,1988,138(3):720-723.
[6] Lin J,Zhang W,Wang L,et al. Diagnostic and prognostic values of Club cell protein 16(CC16)in critical care patients with acute respiratory distress syndrome[J]. J Clin Lab Anal,2017,32(2):32-40.
[7] 钟萍，范贤明，蒋雪莲，等．COPD稳定期患者血清IL-6、IL-18、CC16水平与肺功能及CAT评分的关系[J]．实用医学杂志，2016,32(21):3547-3551.
[8] 张学城，陈东．围急性呼吸窘迫综合征血清CC16蛋白水平的预警意义[J]．罕少疾病杂志，2016,23(5):11-12.
[9] 侯昌权，陈文凯．连续性静脉-静脉血液滤过治疗急性呼吸窘迫综合征患者炎症因子水平及动脉血气的影响[J]．内科急危重症杂志，2017,23(1):37-39.
[10] 秦蘅，王导新．中青年和老年中、重度急性呼吸窘迫综合征患者的预后相关危险因素分析[J]．现代医药卫生，2017,33(14):2087-2090.
[11] Rahmel T,Rump K,Adamzik M,et al. Increased circulating microRNA-122 is associated with mortality and acute liver injury in the acute respiratory distress syndrome[J]. BMC Anesthesiol,2018,18(1):75-87.
[12] 陈军，谭德敏，陈绵军．急性呼吸窘迫综合征患者氧合指数、血管外肺水指数的动态变化及其临床意义[J]．内科急危重症杂志，2018,24(2):150-152.
[13] Wang C Y,Calfee C S,Paul D W,et al. One-year mortality and predictors of death among hospital survivors of acute respiratory distress syndrome[J]. Intensive Care Med,2014,40(3):388-396.
关键词：急性呼吸窘迫综合征; 血清Cc16蛋白; miRNA-122; 预后;
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由非心原性因素引起的急性弥漫性肺部炎症，患者多表现为呼吸窘迫、低氧血症、低顺应性。有报道称，Cc16蛋白可作为ARDS的早期标志物[1]。miRNAs是内源基因编码的非编码单链RNA，可通过诱导或沉默基因的表达进而参与疾病的发生发展过程[2]。miRNA-122是一种肝脏特有RNA，其参与肝脏的多种生理、病理发展过程，可作为急性肝损伤的早期标志物。研究报道，miRNA-122可以预测ARDS患者的死亡率[3]。本研究探讨ARDS患者Cc16蛋白、miRNA-122表达水平与预后的关系，报道如下。
资料与方法
一般资料选取2015年6月～2017年8月新汶矿业集团莱芜中心医院收治的ARDS患者68例，其中重症肺部感染46例，复合外伤11例，坏死性肠梗阻8例，糖尿病肾病3例，分为存活组15例(男8，女7)，年龄18～68岁，平均(44.33±14.25)岁，病程4～18d，平均(9.65±1.12)d;死亡组53例(男29，女24)，年龄18～70岁，平均(45.12±13.22)岁，病程3～19d，平均(9.81±1.06)d;另选取同期参加体检的健康者45例(男25，女20)为对照组，年龄18～70岁，平均(43.56±12.03)岁。纳入标准:符合美国/欧洲共识委员会ARDS标准[4];患者既往无ARDS病史;无慢性肝病。排除合并其他严重肺部和肝性疾病及临床资料不全者。患者均知情且签署同意书。方法收集受试者性别、年龄、体重指数(body mass index,BMI)、平均肺动脉压、平均气道压、肺损伤评分等临床资料，其中肺损伤采用Murray等[5]提出的肺损伤评分(lung injury score,LIS)体系，0分为无肺损伤，分值越高，肺损伤越严重。患者入ICU后24 h内采集血液5 m L，于室温避光静置15 min,3 000 r/min离心15 min，分离血清于无菌EP管中，置于-20℃冰箱中保存待测，避免反复冻融。采用全自动生化分析仪(日式7020)测定天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素浓度，试剂盒购自南京建成生物工程研究所;采用酶联免疫吸附法检测血清Cc16蛋白、C反应蛋白、降钙素原水平，试剂盒购自上海沪宇生物科技有限公司，检测步骤按照试剂盒说明书进行。
按照miRNA试剂盒说明书提取血清总RNA，核酸蛋白检测仪测定miRNA的光密度(optical density,OD)，计算miRNA的纯度和浓度。使用miR-NA反转录试剂盒(TAKARA公司)将miRNA反转录为cDNA;逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法检测血清中miRNA-122的相对表达量。RT-qPCR反应体系为20 L:2×miRcute miRNA Premix 10 L，上下游引物各0.5 L,c DNA模板2 L,dd H2O补足20 L;反应设置为94℃预变性2 min,94℃20 s,60℃20 s,72℃延伸20 s，共40个循环。以U6为内参基因。引物由上海生工合成，引物序列，基因:U6，正向引物5'-3':ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，反向引物5'-3':GGAACGCTTCACGAATTTG;基因:miR-NA，正向引物5'-3':CAAGCGTTGGAGTGTGACA，反向引物5'-3':CGTCCTACCATTCTCCAGC。反应结束后采用2-ΔΔCt法计算miRNA-122的相对表达量。随访30d，统计生存率。
统计学处理采用SPSS 20.0统计软件包，计量资料以
表示，2组间比较采用t检验，3组比较采用方差分析;计数资料以百分数(%)表示，采用χ2检验;采用Kaplan-Meier法对患者的生存期进行分析，Logistic分析影响患者预后的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一般资料各组年龄、性别、BMI比较，差异无统计学意义(均P>0.05),ARDS存活组与死亡组平均肺动脉压、平均气道压、肺损伤评分、C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16蛋白显着高于对照组，且死亡组C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16蛋白高于存活组(均P<0.05)，见表1。表1 各组一般资料比较
miRNA-122水平RT-qPCR检测显示ARDS死亡组与存活组患者miRNA-122表达水平显着高于对照组(P<0.05)，且死亡组高于存活组(P<0.05)，见图1、表2。
图1 miRNA-122表达水平
注:*P<0.05,**P<0.01
表2 各组miRNA-122表达水平
Cc16蛋白、miRNA-122与ARDS患者预后的关系Kaplan-Meier分析结果显示Cc16蛋白低表达组生存率显着高于高表达组(51.85%vs 18.15%,P<0.01),miRNA-122低表达组生存率显着高于高表达组(60.92%vs 20.13%,P<0.05)。
影响ARDS预后的单因素Logistic分析以预后为因变量，以可能影响预后的因素为自变量进行Logistic单因素分析，结果显示ARDS预后与C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16、miRNA-122相关(均P<0.05)，见表3。
表3 ARDS预后的单因素Logistic比较
影响ARDS预后的多因素Logistic分析将单因素分析中与ARDS预后相关的指标纳入Logistic回归模型，分析结果显示ALT、Cc16、miRNA-122是影响ARDS预后的独立危险因素，见表4。
表4 ARDS预后的多因素Logistic分析
讨论
肺顺应性与远端细支气管弹性密切相关，顺应性越高，扩张程度越大[6]。本研究中ARDS存活组与死亡组平均肺动脉压、平均气道压、肺损伤评分、C反应蛋白、降钙素原、ALT、AST、总胆红素、Cc16蛋白显着高于对照组，表明ARDS患者肺顺应性差、出现严重的呼吸窘迫现象，并存在严重肺部炎症，部分患者肝脏疾病也处于极其严重状态。Cc16细胞通过分泌特异性蛋白Cc16，参与细支气管修复和毒素清除，Cc16蛋白可作为肺-血屏障、肺泡原毛细血管通透性完整的敏感标志物[7,8]。初期ARDS患者因抗氧化应激增强，Cc16细胞分泌Cc16蛋白增多，血清Cc16水平升高[9]。随着病情加重，Cc16细胞受损，分泌能力减弱，Cc16蛋白水平下降。但ARDS恶化造成屏障完整性受损，通透性增强，血清Cc16蛋白水平仍然增加[10]。本研究中ARDS死亡组与存活组患者Cc16蛋白水平显着高于对照组，且死亡组高于存活组，表明随着病情恶化，Cc16蛋白显着升高。Kaplan-Meier分析显示Cc16蛋白低表达组生存率显着高于高表达组，且Cc16蛋白是影响患者预后的危险因素。
miRNA广泛表达于多种动植物中，其通过抑制靶基因转录、促进其降解。研究报道miRNA-122是急性肝损伤的早期标志物[11]。miRNA-122在ARDS引起的微血管损伤、微血管血流、细胞氧合中也具有重要作用[12]。Wang等[13]研究表明miRNA-122可作为ARDS的标志物且与患者28 d生存率相关。本研究中ARDS组miRNA-122蛋白水平显着高于对照组，死亡组显着高于存活组，表明miRNA-122参与疾病的进展。Kaplan-Meier分析结果显示miRNA-122表达与ARDS患者生存率显着相关，miRNA-122低表达组生存率显着高于高表达组。Logistic单因素、多因素分析显示miRNA-122是影响患者预后的危险因素。
参考文献
[1]林锦乐，傅萱，曾世永，等．急性呼吸窘迫综合征患者血清Clara细胞蛋白16表达及与肺顺应性关系[J]．中华实用诊断与治疗杂志，2018,32(3):265-268.
[2] 周巧．微RNAs调控p38MAPK信号通路与疾病关系的研究进展[J]．重庆医学，2018,47(16):104-106.
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[5] Murray JF,Matthay MA,Luce JM,et al. An expanded definition of the adult respiratory distress syndrome[J]. Am Rev Respir Dis,1988,138(3):720-723.
[6] Lin J,Zhang W,Wang L,et al. Diagnostic and prognostic values of Club cell protein 16(CC16)in critical care patients with acute respiratory distress syndrome[J]. J Clin Lab Anal,2017,32(2):32-40.
[7] 钟萍，范贤明，蒋雪莲，等．COPD稳定期患者血清IL-6、IL-18、CC16水平与肺功能及CAT评分的关系[J]．实用医学杂志，2016,32(21):3547-3551.
[8] 张学城，陈东．围急性呼吸窘迫综合征血清CC16蛋白水平的预警意义[J]．罕少疾病杂志，2016,23(5):11-12.
[9] 侯昌权，陈文凯．连续性静脉-静脉血液滤过治疗急性呼吸窘迫综合征患者炎症因子水平及动脉血气的影响[J]．内科急危重症杂志，2017,23(1):37-39.
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[11] Rahmel T,Rump K,Adamzik M,et al. Increased circulating microRNA-122 is associated with mortality and acute liver injury in the acute respiratory distress syndrome[J]. BMC Anesthesiol,2018,18(1):75-87.
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[13] Wang C Y,Calfee C S,Paul D W,et al. One-year mortality and predictors of death among hospital survivors of acute respiratory distress syndrome[J]. Intensive Care Med,2014,40(3):388-396.