乳腺癌组织中干细胞CD44+/CD24-表型与预后的关系

王 岫1 吴 捷1 彭旭佳1 刘 强2

1.上海市长宁区同仁医院病理科，上海 200000； 2.上海市仁济医院病理科，上海 200050

[摘要] 目的 探讨CD44+/CD24-表型与病理类型、临床病理特征的及乳腺癌预后生存情况的关系。方法 应用免疫组织化学CD44/CD24双染方法检测100例乳腺癌CD44/CD24双染的情况，分析CD44+/CD24-表型情况及其与病理类型、临床病理及生存情况的相关性。 结果 CD44+/CD24-细胞表型阳性患者和阴性患者在年龄，绝经状况，病例分级，临床分期，肿瘤直径大小，淋巴结转移状况，复发状况，雌激素受体（ER）与孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子受体-2（HER2）等临床病例参数均差异无统计学意义（P＞0.05）。CD44+/CD24-细胞表型阳性组与阴性组中位生存时间比较发现两组生存时间无统计学差异（χ2=0.017， P=0.897）。结论 乳腺癌CD44+/CD24-细胞表型表达情况与乳腺癌生存时间无相关性。

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关键词 乳腺肿瘤； CD44+/CD24-细胞； 免疫组织化学； 预后

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）02（c）－０057-03

The Relationship Between Phenotype of Stem Cells CD44 + / CD24- and Prognosis about Breast Cancer

WANG Xiu1 WU Jie1 PENG Xujia1 LIU Qiang2

1.Department of Pathology， Shanghai Tongren Hospital in Changning District， Shanghai， 200050， China；

2.Department of Pathology， Shanghai Renji Hospital， Shanghai， 200050， China

[Abstract] Objective To investigate the expressions of CD44+/CD24-cells and clinical pathological types in breast carcinoma and their relationship with the prognosis of the patients. Methods Double-staining immunohistochemistry was applied to detect CD44 and CD24 of a series of 100 paraffin-embedded breast tissue specimens. The correlation between the phenotype， pathological types and clinical pathology of CD44+/CD24-， and the prognosis was analyzed. Results No statistical significances were shown between the positive and the negative groups of CD44+/CD24- genotypes in the clinical parameters such as age， menopausal status， histological grade， clinical stage， tumor size， lymphoid metastasis， recurrence status， ER， PR， HER2 (P >0.05). The median survival times between the positive and the negative groups of CD44+/CD24- genotypes were not statistically significant （χ2=0.017， P=0.897）. Conclusion The status of the CD44+/CD24- genotypes has no relationships with the prognosis of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； CD44+/CD24-cells； Immunohistochemistry； Prognosis

[课题项目]编号：2011Q003。

[作者简介] 王岫（1984，8-），女，黑龙江人，本科，住院医师，研究方向：临床病理，邮箱：wangxiu7973@126.com。

[通讯作者] 刘强(1963-)，男，博士，上海交通大学医学院附属仁济医院病理科主任医师，研究方向:淋巴造血系统、泌尿系统，邮箱:liuq1963@sohu.com。

乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%~10%[1]，是女性最常见的恶性肿瘤之一。上世纪90年代以来，乳腺癌的发病率在我国以平均每年约3%的速度增长。研究表明，一小部分肿瘤干细胞（CSCs）存在于乳腺癌中，它们对化、放疗有抵抗性，并可再次形成肿瘤，可能是肿瘤复发的根源[2-3]。为此，研究者提出了肿瘤干细胞的概念。理论认为，肿瘤是由一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞及由其产生的分化程度不均一的细胞团组成的病态“器官”。那一小群细胞具有自我更新、分化和形成肿瘤的能力，类似正常体细胞中的干细胞，故被称为肿瘤干细胞。目前提出的肿瘤干细胞学说认为，肿瘤组织中存在的干细胞影响肿瘤病人的预后。但乳腺癌肿瘤细胞中的干细胞表型CD44+/CD24-表型的多少与乳腺癌的病理类型、临床病理特征及乳腺癌预后的关系目前尚有争议。因此，该研究通过乳腺癌手术标本的常规病理切片，应用免疫组织化学检测其CD44/CD24双染的情况，探讨CD44+/CD24-表型与病理类型、临床病理特征的及乳腺癌预后生存情况的关系，为今后乳腺癌的诊断治疗提供有价值的参考，将100例乳腺癌患者的常规切片进行检测，现报道如下。

1 资料与方法

将100例乳腺癌患者的常规切片，应用免疫组织化学检测其CD44/CD24双染的情况，分析CD44+/CD24-表型情况及其与病理类型、临床病理及生存情况的相关性。

1.1 一般资料

选取2005年9月—2010年10月间同仁医院病理科近100例乳腺浸润性导管癌病例，该病例均经病理组织学检查证实。术前均未接受过放疗和化疗。100例患者均为女性，年龄25~88岁，平均年龄59岁，查看所有常规HE切片，所有病例均由2位高年资病理医师复习切片，并按照2003年WHO乳腺和女性生殖系统病理学和遗传学分类标准诊断分型，选取出所含肿瘤成分较多的石蜡组织块。

1.2 实验方法

免疫组织化学CD44/CD24双染方法：标本切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，微波炉进行抗原热修复，在3％的H2O2中孵育10 min，用即用型封闭液孵育10 min后PBS液漂洗3次，然后将CD24一抗（工作浓度为1比75）和CD44一抗（工作浓度为1比50）混合物加入切片上，4 0C冰箱孵育过夜；第2天取出在37 ℃中孵育40 min后PBS液漂洗3次滴加生物素标记的第二抗体（CD44，CD24两种二抗等量混合）；湿盒中孵育30 min后PBS液漂洗3次，按试剂盒说明配好DAB显色液和AP-Red显色液进行显色；蒸馏水冲洗后进行苏木精复染，自来水冲洗2～3 min后放入PBS中返蓝，去离子水冲洗后用封片剂复盖组织、不加盖玻片，水平放置与50 ℃烤箱孵育30 min；为了证明CD44/CD24双染的可靠性，用CD44和CD24单染免疫组织化学做对照。

1.3 仪器与试剂

将选取的石蜡组织块用德国Leica 2235型切片机，设置3u厚度，常规切取白片，置62.9 ℃温箱备用。

1.4 结果判断标准

根据WHO规定，双重免疫组织化学检测CD44和CD24，CD44表达于细胞膜上呈棕黄色（DAB显色），CD24表达于细胞质中呈红色（PA-red显色）。双染结果细胞膜呈棕黄色无红色的细胞鉴定为CD44+/CD24-表型肿瘤干细胞。结果判断参照Honeth等的评定方法：阳性细胞≥1为（+）。免疫组织化学的结果是在光学显微镜OLYMPUS BX51型及Leica DMLS型下进行读片，然后根据标准鉴定得出结论（由两位病理医师分别阅片）。

1.5 统计方法

所有统计学分析应用spss13.0统计软件，率的比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier单因素分析进行生成分析，生存曲线差异通过Log-rank检验进行。

2 结果

2.1 乳腺癌病例基线资料情况比较

100例浸润性导管癌组织中，6例CD44+/CD24-细胞表型阳性的患者，94例患者为CD44+/CD24-细胞表型为阴性，CD44+/CD24-细胞表型阳性率占6%。通过χ2检验发现，CD44+/CD24-细胞表型阳性患者和阴性患者在年龄，绝经状况，病例分级，临床分期，肿瘤直径大小，淋巴结转移状况，复发状况，雌激素受体（ER）与孕激素受体（PR）以及人表皮生长因子受体-2（HER2）等临床病例参数均差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表1。

2.2 乳腺癌组织细胞中CD44+/CD24-细胞表型的表达与患者生存情况的关系

乳腺癌患者生存时间按术后到患者死亡或者观察期结束，乳腺癌组织细胞中CD44+/CD24-细胞表型阳性组与阴性组中位生存时间分别为48.00个月(95% CI: 35.73~60.27)与52.17个月（95% CI: 47.01~57.32）。用Log-rank检验两组生存曲线差异，发现两组生存时间差异无统计学意义（χ2=0.017，P=0.897，P＞0.05），提示CD44+/CD24-细胞表型表达情况与乳腺癌生存时间无相关性，见图1。

3 讨论

乳腺癌干细胞是一群CD44+/CD24-的特异细胞群，Benny K. Abraham等人的研究发现其在正常乳腺组织中表达阳性率为0%~40%，但是在乳腺癌组织中的表达阳性率为0%~80%[4]。该研究中CD44+/CD24-的表达阳性率为6.00%。同时发现CD44+/CD24-细胞表型的表达与年龄，绝经状况，病例分级等临床病例参数均无统计学关联。通过乳腺癌组织细胞中CD44+/CD24-细胞表型的表达与患者生存情况的研究发现两者之间没有相关性，CD44+/CD24-细胞中表型的表达情况不会影响乳腺癌患者的生存时间。

目前，乳腺癌干细胞的相关基础研究仍存在许多问题[5]，关于CD44+/CD24-表型的表达与乳腺癌生存时间的关系的研究国内外仍然存在很大争议[6]，2003年Al-Hajj等首先利用NOD/sciD小鼠乳腺脂肪垫内移植与流式细胞分析，从人原发性乳腺癌与乳腺癌转移性胸水渗出液分离出具有自我更新与分化潜能特性的CD44+/CD24-/low癌细胞系[2]。以后很多研究表明CD44+/CD24-乳腺癌细胞具有肿瘤起源的特性[7]。但是，最近一些研究表明CD44+/CD24-表型的表达与乳腺癌生存时间无关，2008年Eleni Mylona等人在希腊开展的相关研究表明， CD44+/CD24-细胞表型的表达与年龄，绝经状况，病例分级，雌激素受体和孕激素受体等临床病例参数无关联。CD44+/CD24-表型的表达与乳腺癌无瘤生存和总的生存时间均无关，但是CD44-/CD24+表型可能与乳腺癌的无瘤生存期有关[8]，该发现与我们的研究具有较好的一致性。但是，2012年Mohamed等人采用1036例乳腺癌病例分析发现CD44+/CD24-表型的表达与其他表型比较，生存期显著性高于其他表型，即CD44-/CD24-， CD44+/CD44+和CD44-/CD24+3种表型[9]。

在肿瘤细胞中表达的具有干细胞特性的肿瘤标志物，对于肿瘤干细胞的分离鉴定，肿瘤的临床诊断和筛查，靶向治疗的新型药物的开发，起着十分重要的作用， CD44+/CD24细胞亚群是最早用于筛选和富集乳腺癌干细胞亚群的肿瘤标志物，但是该研究与国内外的其他研究说明其特异性和应用的意义仍有一定的争论[5]，该研究选取100例浸润性乳腺癌患者分析了CD44+/CD24-表型与乳腺癌预后生存时间的关系，为将来乳腺癌肿瘤标志物的筛选提供了有价值的参考，同时，更加全面深入的关于不同CD44，CD24表型与不同类型乳腺癌关系的研究仍有待进一步开展。

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参考文献

[1] Ferlay J， Shin HR， Bray F， et al. GLOBOCAN 2008， Cancer incidence and mortality worldwide: IARC Cancer Base No.10 [Internet]. Lyon (France): IARC； 2010. Available at: http://globocan.iarc.fr/.

[2] Al-Hajj M， Wicha MS， Benito-Hernandez A， et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA ，2003，100(7):3983–3988.

[3] Ponti D， Costa A， Zaffaroni N， et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J]. Cancer Res，2005，65(13):5506–5511.

[4] Abraham BK， Fritz P， McClellan M， et al. Prevalence of CD44+/CD24?/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favor distant metastasis[J]. Clin Cancer Res， 2005，11(3):1154-60.

[5] Perou CM， Sorlie T， Eisen MB， et al. Molecular portraits of human breast tumours[J]. Nature， 2000， 406:747-752.

[6] Minn AJ， Gupta GP， Siegel PM， et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung[J]. Nature， 2005， 436:518-524.

[7] Mundy GR. Metastasis to bone: causes， consequences and therapeutic opportunities[J]. Nat Rev Cancer， 2002， 2:584-593.

[8] Eleni M， Ioanna G， Emmanouil F， et al. The clinicopathologic and prognostic significance of CD44+/CD24 /low and CD44/CD24+ tumor cells in invasive breast carcinomas[J]. Hum Path，2008，39(7):1096-1102.

[9] Ahmed MA， Aleskandarany MA， Rakha EA， et al. A CD44-/CD24+ phenotype is a poor prognostic marker in early invasive breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat，2012，133(3):979-995.

（收稿日期：2014-01-15）

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