荷梗中的细胞毒活性生物碱

　　[摘要]研究植物莲NelumbonuciferaGaertn干燥茎的生物碱类成分及其细胞毒活性，为进一步开发利用荷梗提供依据。采用离子交换树脂、硅胶和SephadexLH-20柱色谱等方法分离纯化，并运用波谱方法对所分离的化合物进行结构鉴定。采用MTT法对所分离得到的化合物进行HL-60癌细胞毒活性实验。从荷梗总生物碱提取物中分离鉴定了15个生物碱类化合物，分别为阿西米洛宾（1）、异乌药碱（2）、N-乙酰基去甲杏黄罂粟碱（3）、厚壳桂素（4）、velucryptine（5）、pycnarrhine（6）、鹅掌楸碱（7）、荷叶碱（8）、降荷叶碱（9）、杏黄罂粟碱（10）、N-甲基阿西米洛宾（11）、乌药碱（12）、N-去甲杏黄罂粟碱（13）、N-甲基乌药碱（14）、观音莲明（15）。化合物1～7，12～15为首次从荷梗中分离得到。化合物2～6为首次从莲科植物中分离得到。在样品溶液浓度为1×10-5mol·L-1的条件下，化合物7～10，13，14对HL-60癌细胞体外生长的抑制率分别是51.36%，59.09%，52.51%，53.93%，51.43%和64.31%，表明上述化合物对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞具有较明显的体外细胞毒活性。

　　[关键词]莲；荷梗；生物碱；细胞毒活性

　　莲属于睡莲科Nymphaeaceae莲亚科Subfam.Nelumboideae，为多年生水生草本植物，在我国南北各省都有分布。其干燥叶具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血之功效，主要用于暑热烦渴、暑湿泄泻、脾虚泄泻、血热吐衄、便血崩漏等[1]。国内外学者已对荷叶的化学成分进行了系统的研究，发现其主要含有生物碱类、黄酮类、有机酸类成分[2-3]。而荷梗的化学成分研究报道较少，作者对其生物碱类成分进行了较深入的研究，发现了一个新的假苄基异喹啉型生物碱[4]。在此基础上，进一步对其生物碱类成分进行了研究，从其总生物碱提取物中分离得到15个化合物。经波谱方法分别鉴定为阿西米洛宾（1）、异乌药碱（2）、N-乙酰基去甲杏黄罂粟碱（3）、厚壳桂素（4）、velucryptine（5）、pycnarrhine（6）、鹅掌楸碱（7）、荷叶碱（8）、降荷叶碱（9）、杏黄罂粟碱（10）、N-甲基阿西米洛宾（11）、乌药碱（12）、N-去甲杏黄罂粟碱（13）、N-甲基乌药碱（14）、观音莲明（15）。其中，化合物1～7，12～15为首次从荷梗中分离得到。化合物2～6为首次从莲科植物中分离得到。采用MTT法对所分离得到的15个化合物进行细胞毒活性的初筛，结果表明：化合物7～10，13，14对HL-60癌细胞具有较明显的体外细胞毒活性。在1×10-5mol·L-1的条件下，对HL-60癌细胞体外生长的抑制率分别是51.36%，59.09%，52.51%，53.93%，51.43%和64.31%。

　　1材料

　　熔点用X-4数字显示显微熔点仪（温度未校正）；电喷雾电离质谱（ESI-MS）使用HP-1100LC/API/MSD系统；BrukerAV-300和AV-500核磁共振仪（TMS内标）；循环水真空泵DLSB-10L（巩义市英峪仪器厂）；KQ-300超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；柱色谱用硅胶（100～200，200～300目，青岛海洋化工厂）；SephadexLH-20（Pharmacia公司）；IRC-50型离子交换树脂（国药集团化学试剂有限公司）；所用试剂均为分析纯。

　　实验药材于2005年10月采自福建省建宁市，经建宁市科技局姜景魁工程师鉴定为莲科植物N.nucifera的干燥茎。凭证样品（N200510）保留在中国药科大学天然药物化学教研室。

　　2提取与分离

　　荷梗干燥样品30kg经适当粉碎后，用0.5%稀盐酸溶液浸提3次，每次48h，浸出液合并，滤过，通过IRC-50型阳离子交换树脂，树脂水洗，阴干后用浓氨水碱化，风干，以氯仿索氏回流至生物碱提尽，提取液合并，减压浓缩，得浸膏55g。浸膏用少量混合溶剂溶解，加入60g（200～300目）硅胶均匀拌样，挥干溶剂后，用600g硅胶（200～300目）进行柱色谱分离，以氯仿-甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱（1∶0～0∶1），合并TLC行为大致相同的组分，得到8个不同极性段组分：A（100∶0），B（50∶1），C（20∶1），D（10∶1），E（5∶1），F（3∶1），G（1∶1），H（0∶1）。对组分A（2.6g）进一步硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（3∶1～1∶1）进行梯度洗脱，得到5个流分FrA1～FrA5，FrA1硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（30∶1）洗脱，得化合物1（18mg），FrA2硅胶柱色谱以二氯甲烷-丙酮（50∶1）洗脱，得化合物11（205mg），FrA4经SephadexLH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得到化合物3（11mg），9（35mg）。对组分B（3.1g）进一步硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯（3∶1）作为洗脱溶剂反复进行柱色谱分离，得到化合物7（130mg），13（28mg），14（13mg）。对组分C（1.5g）进一步硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（5∶1）和氯仿-甲醇（15∶1）作为洗脱溶剂反复进行柱色谱分离，再经SephadexLH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得到化合物2（20mg），12（9mg）。对组分D（8.7g）进一步硅胶柱色谱分离，以氯仿-丙酮（4∶1～1∶1）梯度洗脱得到4个流分FrD1～FrD4，FrD1首先经SephadexLH-20柱色谱初步分离，以氯仿-甲醇（1∶1）为洗脱溶剂，然后以石油醚-丙酮（2∶1）作为洗脱溶剂反复进行硅胶柱色谱分离，得到化合物8（1500mg），FrD2以氯仿-甲醇（8∶1）作为洗脱溶剂反复进行硅胶柱色谱分离，得到化合物10（6.6mg），15（9.2mg）。对组分E（2.3g）进一步硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇（5∶1～1∶1）梯度洗脱得到3个流分FrE1～FrE3，FrE1首先以氯仿-丙酮（3∶1）为洗脱溶剂反复进行硅胶柱色谱分离，再经SephadexLH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，得到化合物4（16mg），FrE3以二氯甲烷-甲醇（2∶1）为洗脱溶剂反复进行硅胶柱色谱分离，得到化合物5（10mg）。组分F（0.8g）经SephadexLH-20柱色谱（甲醇洗脱）分离纯化，反复重结晶后，得到化合物6（8mg）。

　　3结构鉴定

　　化合物1无色块晶（CHCl3）；改良碘化铋钾试剂显橘红色；1H-NMR（CD3COCD3，300MHz）δ：8.32（1H，d，J=7.9Hz，H-11），7.18～7.31（3H，m，H-8～10），6.63（1H，s，H-3），3.67（1H，dd，J=4.6，9.1Hz，H-6a），3.57（3H，s，-OMe），2.54～3.31（6H，m，H-4，5，7）；13C-NMR（CD3COCD3，75MHz）δ：144.5（C-1），126.5（C-1a），129.6（C-1b），150.0（C-2），116.4（C-3），131.1（C-3a），30.4（C-4），44.1（C-5），54.8（C-6a），38.4（C-7），137.8（C-7a），128.8（C-8），128.4（C-9），128.1（C-10），127.7（C-11），133.5（C-11a），60.4（1-OMe）。以上数据与文献[5]报道基本一致，鉴定为阿西米洛宾。