Smurf2在小管上皮细胞转分化中的表达及MG—132对其的影响
2022-06-09
肾间质纤维化几乎是所有肾脏疾病发展的最终结局，肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymaltransitionEMT）是其关键步骤，表现为细胞极性消失，表达间充质细胞标记物α--平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,同时失去上皮细胞标记物E-钙依赖蛋白（E-cadherin）和角质蛋白（cytokeratin）。TGF-?1是多效能细胞因子，是EMT的关键因子，TGF-?1/Smad信号活性亢进在其过程中发挥了重要作用[1-3]。Smad泛素化调节因子2(Smadubiquitinregulatoryfactor2,Smurf2)是E3泛素蛋白质连接酶家族的成员，因其特异性底物识别功能，在调节TGF-β1/-Smads信号通路中起关键的作用[4]。本研究观察Smurf2在TGF-?1致人近端小管上皮细胞（HK2）转分化中的表达变化，Smurf2对TGF-β1/Smads信号途径介质的作用及泛素蛋白酶体阻断剂MG-132对其干预后表达的影响，为小管间质纤维化的防治寻找新的策略。
1材料与方法
1.1主要试剂与设备实验用人近端小管上皮细胞株（HK2）由北京协和医院赠予。1：50鼠抗人α—SMA单克隆抗体及SP试剂盒购自福州迈新公司。抗SnoN抗体购置SantaCruz公司，抗phospho-Smad2/3、Smad2/3抗体，CellSignaling,US。固体MG-132，购自ALEXIS公司,UK。Western-blot主要试剂及提取总RNA的Trizol购自广州威佳公司。随机引物和MMLV逆转录酶、RNA酶抑制、2.0mMdNTP、TaqDNA聚合酶、DNAMARKER、PCR引物，购自上海生工公司。仪器Western-blot电泳仪，BIO-RAD,美国。荧光显微镜来自ZEISS，德国。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养方法参考文献[13]
1.2.2试验分组体外培养的人近端小管上皮细胞分为4组：对照组（正常人近端小管上皮细胞）、TGF-?1（5ng/ml）组、TGF-?1(5ng/ml)+MG-132(UPP阻断剂，2.5umol/ml)组和MG-132(2.5umol/ml)组。
1.2.3免疫荧光采用SP二步法，具体步骤严格按照试剂盒说明书，荧光显微镜下阅片。实验重复3次。
1.2.4Westernblot检测方法见参考文献[13]，凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的吸光度值。实验重复3次。
1.2.5RT-PCR扩增Trizol一步法提取细胞总RNA，引物由上海生工合成。基本参数如下。
取PCR产物3μl，PCRMarker作对照，1.2%琼脂糖凝胶上电泳45分钟，电泳条件：120V恒压，紫外透射仪上观察结果。一次性成像系统拍照，软件定量分析，实验重复3次。
1.3统计学分析实验数据以均数±标准差（）表示。所有数据经医学统计软件包SPSS(12.0版)处理，组间均数比较采用t检验或单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1TGF-?1和UPP阻断剂MG-132对细胞中Smurf2mRNA表达的影响
TGF-?1作用于HK2细胞后可诱导Smurf2mRNA表达迅速上调，10min为对照组的1.21倍，1h时为对照组的3.96倍(P<0.01)，24h有所恢复但仍为对照组的1.58倍(P<0.05)。以1h为时间点观察4组中Smurf2mRNA水平表达，对照组中有基础量的Smurf2mRNA分泌，TGF-?1+MG-132组中Smurf2mRNA表达与对照组及MG-132组差异无统计学意义，与TGF-?1组相比，Smurf2mRNA水平明显下调(P<0.01)。
2.2TGF-?1和UPP阻断剂MG-132对细胞中Smurf2蛋白表达的影响
TGF-?1作用于细胞后可诱导Smurf2蛋白表达迅速上调，1h为对照组的1.96倍（P<0.05），并呈时间依赖性，24h有所恢复但仍为对照组的0.73倍(P<0.05)。以1h作为时间点观察4组中Smurf2蛋白水平表达，结果显示：对照组中有基础量的Smurf2蛋白表达，TGF-?1组中Smurf2蛋白表达为对照组的1.96倍，TGF-?1+MG-132组中Smurf2蛋白表达与对照组及MG-132组差异无统计学意义，与TGF-?1组相比，Smurf2蛋白水平明显下调(P<0.05)。
2.3TGF-?1和泛素系统阻断剂MG-132对细胞中SnoNmRNA表达的影响
TGF-?1（5ng/ml）作用于细胞10min即可诱导SnoNmRNA表达升高，（与0min比较，P<0.05）,并呈时间依赖性，24h后较0min增高0.96倍(P<0.01)。24h时观察4组SnoNmRNA表达。结果显示：对照组及MG-132组基本未见SnoNmRNA表达，24hTGF-?1组与TGF-?1+MG-132组SnoNmRNA表达无差异，但均较对照组及MG-132组显著升高（P<0.05）。
2.4TGF-?1和UPP阻断剂MG-132对细胞中SnoN蛋白表达水平的影响
TGF-?1（5ng/ml）作用于细胞后，与SnoNmRNA表达不同，SnoN蛋白表达迅速减少，10min时减少３８%，随后逐渐减少，12h仅为对照组10%（P<0.01），24h有所恢复但仍较对照组明显降低（P<0.01）。以12h作为时间点，观察4组SnoN蛋白表达。结果显示：对照组含丰富内源性SnoN蛋白，12hTGF-?1组SnoN表达仅为对照组10%(P<0.01),TGF-?1+MG-132组SnoN蛋白表达与对照组及MG-132组差异无统计学意义。
2.5TGF-?1及泛素系统阻断剂MG-132对细胞中Smad2/3磷酸化水平影响